ICS65.160 X85 中华人民共和国国家标准 GB/T15699—2013 代替GB15699—1995 烟 草霜霉病检疫规程 Rulesfortobaccobluemoldquarantine 2013-11-12发布 2014-04-11实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替GB15699—1995《烟草种子霜霉病检疫规程》,与GB15699—1995相比主要技术变化 如下: ———将适用范围扩大为“各种入境烟草种子、种苗和烟叶的霜霉病检疫”(见第1章,1995年版的 第1章); ———增加了“规范性引用文件”(见第2章); ———增加了“技术原理”(见第4章); ———增加了“烟叶和种苗”的取样(见6.1.2和6.1.3); ———增加了“烟叶和种苗”中孢子囊和孢子梗的检验(见6.2.2和6.2.3); ———增加了“烟叶”中卵孢子的检测(见6.3.2); ———删除了附录部分(1995年版的附录A、附录B、附录C和附录D); 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家烟草专卖局提出。 本标准由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会(SAC/TC144/SC2)归口。 本标准起草单位:中国农业科学院烟草研究所。 本标准主要起草人:冯全福、孔凡玉、封立平、贾兴华、李启新、张成省、陈长法、高连喜。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: ———GB15699—1995。 ⅠGB/T15699—2013 烟草霜霉病检疫规程 1 范围 本标准规定了烟草霜霉病检疫的程序和方法。 本标准适用于各种入境烟草种子、种苗和烟叶的霜霉病检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T18086—2000 植物检疫 烟霜霉病菌检疫鉴定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 检疫 quarantine 为预防危险性烟草病虫害传播蔓延采取的一种措施。 3.2 烟草霜霉病 tobaccobluemold 又名蓝霉病,由烟草霜霉菌(Peronosporatabacina)引起,主要为害烟草叶片,亦可系统侵染根、茎 维管束,是一种传播迅速具有毁灭性的病害。 注:该病发生于欧洲、美洲、澳洲,目前我国尚无该病发生,因此作为对外检疫对象。病原为Peronsporahyoscyami f.sptabacinaAdam,异名PeronsporanicotianaeSpeg,PeronosporatabacinaAdam,属鞭毛菌亚门(Mastigo- mycotin),卵菌纲(Oomycetes),霜霉目(Peronosporales)霜霉科(Peronosporaceae),霜霉属(Peronospora)。 4 技术原理 4.1 检疫原理 烟草霜霉病菌为专性寄生菌,烟叶被侵染为害后,出现边缘模糊、褪绿的近圆形斑点,后期形成淡褐 色可脱落的坏死病斑。在适宜温湿度条件下,叶背面病斑长出淡蓝色霉状物,即烟草霜霉病菌的孢囊梗 和孢囊;在一定条件下,病组织内可形成卵孢子。病原菌的寄生专化性及其形态学特征是鉴定烟草霜霉 病的依据。 4.2 烟草霜霉病菌的鉴定特征 4.2.1 孢囊和孢囊梗的特征 烟草霜霉病菌的孢囊梗无色,从寄主气孔中伸出,主轴较粗壮,上部呈双叉分枝3次~10次。孢囊 梗长400μm~750μm,基部直径10μm~12μm;分枝角度越分越大,末枝呈钝角分叉,叉枝基部略粗 并向末端变尖,两叉枝长短略有差异,较长的一枝常弯曲,另一枝较直,末枝长7μm~14μm;孢囊在末 1GB/T15699—2013 枝顶端同步形成,易脱落,无色或淡黄色,柠檬形或倒卵形,无乳头状突起,大小为(17μm~28μm)× (13μm~17μm)。 4.2.2 卵孢子的特征 烟草霜霉病的卵孢子壁与藏卵器分离。成熟卵孢子呈橘黄至红褐色,球形,直径为20μm~60μm,外 胞壁常有瘤状饰纹。 5 仪器与试剂 5.1 显微镜 放大倍数为100倍~1000倍。 5.2 双目解剖镜 放大倍数为10倍~50倍。 5.3 电子天平 感量为0.1g。 5.4 离心机 转速为1000r/min~4000r/min。 5.5 不锈钢筛 孔径为60μm。 5.6 振荡器 振速为200r/min。 5.7 血球计数器 5.8 苯胺蓝 5.9 0.02mol/L磷酸缓冲液(pH=7) 5.10 乳酚油 乳酚油的配制:液态苯酚20mL、乳酸20mL、甘油40mL、蒸馏水20mL混合而成。 5.11 10%氢氧化钾溶液 10%氢氧化钾溶液的配制:取氢氧化钾10.0g,加水90mL溶解。 6 检疫程序与方法 6.1 取样 6.1.1 种子 根据待检种子总件数按5%~20%取样。在取样时,按对角线五点、棋盘式或分层取样,每个取样 2GB/T15699—2013 点取样10g~20g,然后混合均匀。 注:旅客携带和国际邮包邮寄的少量烟草种子,取样量视具体情况而定。 6.1.2 烟叶 不同产地、不同等级的烟叶应分别取样,根据货物批量总件数抽取一定数量的样品,500件以下的 抽查20件,少于20件的全批抽查。在每件中抽取一定数量的带可疑病斑的烟叶作为代表性样品,充分 混合后,按缩分法制备出两份样品,每份1kg~4kg。一份为检验样品,另一份为备查样品。按表1抽 取样品份数。 表1 进境烟叶检疫抽查表 单位为件 批量总件数 抽查件数 500以下(含500) 20 501~1000 21~30 1001~3000 31~40 3001~5000 41~50 5001~10000 51~70 10001以上 71~100 6.1.3 种苗 烟草种苗抽样每批按总件数的5%~20%抽查,每批取样检验100株以上,少于100株的全检。 6.2 孢子囊和孢囊梗检验 6.2.1 种子 从6.1.1制备的烟草种子中随机抽取5g,放入三角瓶中,加蒸馏水以完全浸没烟草种子,浸泡30 min,将三角瓶置于振荡器上振荡5min。将上层洗液转移至离心管,以1000r/min的速度离心5min, 倾去上清液,每个离心管再加入适量蒸馏水,用手摇晃,使沉淀物重新悬浮在蒸馏水中,取几滴悬浮液涂 于载玻片上,每个样品应制备5个~10个载玻片,用显微镜(5.1)在400倍~500倍放大倍数下查看,检 查每个载玻片10个视野(见图1)内的枝状孢子囊梗和孢子囊。 1 2 3 5 4 6 7 8 10 9 图1 10个视野在载玻片上的分布 6.2.2 烟叶 6.2.2.1 病叶检查 从6.1.2制备的烟叶样品中随机抽取1kg,在光线充足处,逐片检查,迎光透视,可见明显病斑,若 3GB/T15699—2013 发现叶片背面病斑上有密生灰褐色霉层,则用显微镜进一步检验。 6.2.2.2 直接镜检 用解剖针挑取烟叶病斑上的霉状物涂在载玻片上,用显微镜在400倍~500倍放大倍数下检查,观 察病原菌的孢子囊梗和孢子囊,记录其形态特征,并测量孢子囊梗的长度和孢子囊的大小,测定数量应 在30个以上。 6.2.2.3 洗涤检验 剪下霜霉不明显的可疑病斑,用蒸馏水浸泡30min,待烟叶软化后,用振荡器振荡5min,将悬浮液 注入离心管,以1000r/min的速度离心5min,然后倾去上层清液,每个离心管再加入适量蒸馏水,使 沉淀物重新悬浮在蒸馏水中,取几滴悬浮液涂于载玻片上,每个样品应制备5个~10个载玻片,用400 倍~500倍显微镜观测,每个载玻片查看10个视野(见图1),检查树枝状孢子囊梗和孢子囊。 6.2.3 种苗检验 检查种苗叶片背面霜霉病症状,用6.2.2.2的方法镜检病原的孢囊梗和孢囊。对可疑烟苗,应作保 湿检查:将可疑烟苗叶片展平,放入预制的直径为15cm~20cm、铺有3层湿滤纸的培养皿中,加盖后 形成小型湿室,置于18℃环境中无光照诱发培养12h~24h,然后在双目镜下仔细检查新生的烟草霜 霉病的孢囊梗和孢囊。 6.3 卵孢子检验 6.3.1 种子 从6.1.1制备的样品中随机抽取5g烟草种子,置于烧杯中,加入10%氢氧化钾水溶液以完全浸没 烟草种子,煮沸15min~30min,直至烟草种子透明,加苯胺蓝(5.8)染色后用乳酚油(5.10)作浮载剂, 然后用显微镜检查,每个样品应检查10个载玻片。 6.3.2 烟叶 按GB/T18086—2000附录A执行。 6.3.3 孢子数量统计 用血球计数器统计孢子数量,观察80个小格,计算80小格内平均孢子数量,按式(1)计算每毫升悬 浮液中孢子的数量。 b=a×4000000 ……………………(1) 式中: b———每毫升悬浮液中孢子的数量,单位为个; a———80小格内的平均孢子数量,单位为个。 6.4 种子萌发检验 6.4.1 检验方法 取300mL的大口径三角瓶4个,每瓶装入培养基80mL,用封口膜封住瓶口,121℃(120kPa)下 灭菌15min。在无菌操作下,每瓶中撒播烟种子100粒,15℃~20℃温箱内培养。待种子萌发后,观 察烟苗上的霜霉病症状。 检查种子内部病菌时,将种子浸入1%次氯酸钠溶液10min,然后置于无菌滤纸上,培养检查。 4GB/T15699—2013