书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ３ — ２０１８ /G21 /G22 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．３ — ２００８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G23 /G26 /G25 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B 犆狅犱犲狅犳犱犻犪犵狀狅狊犻狊犳狅狉狏犻狉犪犾犺犪犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮狊犲狆狋犻犮犪犲犿犻犪 （ 犞犎犛 ） ２０１８  ０７  １３ /G2C /G2D ２０１９  ０２  ０１ /G2E /G2F /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2C /G2D书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．３ — ２００８ 《 鱼类检疫方法 　 第 ３ 部分 ： 病毒性出血性败血症病毒 （ ＶＨＳＶ ）》。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．３ — ２００８ 相比 ， 除编辑性修改外 ， 主要技术变化如下 ： ——— 增加了采样 ； ——— 增加了临床症状 ； ——— 增加了间接免疫荧光抗体试验 （ ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔ ， ＩＦＡＴ ） 检测病毒性出血性败血症病毒抗原的方法 ； ——— 增加了酶联免疫吸附试验 （ ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ ， ＥＬＩＳＡ ） 检测病毒性出血性败血症病毒抗原的方法 ； ——— 增加了 ＲＴＰＣＲ 和荧光 ＲＴＰＣＲ 检测方法 ； ——— 增加了综合判定 ； ——— 增加了 ＶＨＳ 的规范性附录 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出 。 本标准由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 全国水产技术推广总站 、 山东出入境检验检疫局 、 深圳出入境检验检疫局 、 北京出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 余卫忠 、 孙涛 、 尹伟力 、 贾鹏 、 吕永辉 、 谷强 、 张利峰 、 岳志芹 、 王津津 、 江育林 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．１ — １９９５ ； ——— ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．３ — ２００８ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ３ — ２０１８ 病毒性出血性败血症诊断规程 １ 　 范围 本标准规定了病毒性出血性败血症临床症状 、 组织病理学特征 、 病毒分离 、 中和试验 、 间接荧光抗体试验 、 酶联免疫吸附试验 、 逆转录聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应进行鉴定的方法 。 本标准适用于鱼类病毒性出血性败血症的流行病学调查 、 诊断 、 检疫和疫情监测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ 　 出入境动物检疫采样 ＳＣ ／ Ｔ７０１６．１ 　 鱼类细胞系 　 第 １ 部分 ： 胖头 /G21 肌肉细胞系 （ ＦＨＭ ） ＳＣ ／ Ｔ７０１６．５ 　 鱼类细胞系 　 第 ５ 部分 ： 鲤上皮瘤细胞系 （ ＥＰＣ ） ＳＣ ／ Ｔ７０１６．９ 　 鱼类细胞系 　 第 ９ 部分 ： 蓝鳃太阳鱼细胞系 （ ＢＦ２ ） ＳＣ ／ Ｔ７１０３ 　 水生动物产地检疫采样技术规范 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＢＦ２ ： 蓝鳃太阳鱼细胞系 （ ｂｌｕｅｇｉｌｌｆｒｙｃｅｌｌｌｉｎｅ ） ｂｐ ： 碱基对 （ ｂａｓｅｐａｉｒ ） ＣＰＥ ： 细胞病变效应 （ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ ） ＣＴＡＢ ： 十六烷基三甲基溴化铵 （ ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） Ｃｔ ： 循环阈值 （ ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ） ｃＤＮＡ ： 互补脱氧核糖核酸 （ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＤＥＰＣ ： 焦碳酸二乙酯 （ ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ） ｄＮＴＰ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ） ＥＰＣ ： 鲤上皮瘤细胞系 （ ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａｐａｐｕｌｏｓｕｍｃｙｐｒｉｎｉｃｅｌｌｌｉｎｅ ） ＦＢＳ ： 胎牛血清 （ ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ ） ＦＨＭ ： 胖头 /G21 肌肉细胞系 （ ｆａｔｈｅａｄｍｏｎｎｏｗｃｅｌｌｌｉｎｅ ） ＦＩＴＣ ： 异硫氰酸荧光素 （ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ） ＨＥＰＥＳ ： ４ 羟乙基哌嗪乙磺酸 ［ ４ （ ２ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙ１ ） １ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ ］ ＯＰＤ ： 邻苯二胺 （ 狅 ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ） ＰＢＳ ： 磷酸盐缓冲液 （ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ ） ＰＢＳＴ ： 磷酸盐吐温缓冲液 （ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｔｗｅｅｎ２０ ） １ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ３ — ２０１８ ＰＦＵ ： 空斑形成单位 （ ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ ） ＲＴＰＣＲ ： 逆转录聚合酶链式反应 （ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＴＢＥ ： 三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液 （ ＴｒｉｓＢｏｒａｔｅＥＤＴＡ ） ＴＣＩＤ ５０ ： ５０％ 组织细胞感染量 （ ５０％ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ ） ＴＭＢ ： ３ ， ３′ ， ５ ， ５′ 四甲基联苯胺 （ ３ ， ３′ ， ５ ， ５′Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ） Ｔｒｉｓ ： 三 （ 羟甲基 ） 氨基甲烷 ［ ｔｒｉｓ （ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ１ ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ］ ＶＨＳＶ ： 病毒性出血性败血症病毒 （ ｖｉｒａｌｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａｖｉｒｕｓ ） ４ 　 试剂和材料 ４ ． １ 　 水 ： 应符合 ＧＢ６６８２ 中一级水的规格 ， 用于 ＲＴＰＣＲ 时要用 ＤＥＰＣ 处理 ， 除去 ＲＮＡ 酶 。 ４ ． ２ 　 青霉素 。 ４ ． ３ 　 链霉素 。 ４ ． ４ 　 逆转录酶 －２０℃ 保存 ， 避免温度剧烈变化 。 ４ ． ５ 　 ＲＮＡ 酶抑制剂 －２０℃ 保存 ， 避免温度剧烈变化 。 ４ ． ６ 　 ｄＮＴＰ ： 含 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 各 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 。 ４ ． ７ 　 犜犪狇 酶 ： －２０℃ 保存 ， 避免温度剧烈变化 。 ４ ． ８ 　 溴酚蓝 。 ４ ． ９ 　 ＶＨＳＶ 参考株 ： 由农业部相关部门提供 。 ４ ． １０ 　 鼠抗 ＶＨＳＶ 的单克隆抗体 （ 包被用 ）： 由农业部相关部门提供 。 ４ ． １１ 　 抗 ＶＨＳＶ 的参考血清 ： 与包被用单抗不是来源于同一种动物 ， 由农业部相关部门提供 。 ４ ． １２ 　 ＦＩＴＣ 标记的二抗 ： 抗 ４．１１ 中所指动物的抗体 。 ４ ． １３ 　 辣根过氧化物酶标记的二抗 ： 抗 ４．１１ 中所指动物抗体 。 ４ ． １４ 　 阴性对照 ： 正常细胞组织悬液 。 ４ ． １５ 　 鲤鱼上皮瘤细胞 （ ＥＰＣ ）、 蓝鳃太阳鱼细胞 （ ＢＦ２ ）、 胖头 /G21 肌肉细胞 （ ＦＨＭ ） 应分别符合 ＳＣ ／ Ｔ７０１６．５ 、 ＳＣ ／ Ｔ７０１６．９ 和 ＳＣ ／ Ｔ７０１６．１ 的要求 。 ４ ． １６ 　 细胞生长液 ： 用含厄尔平衡盐 （ Ｅａｒｌｅ ’ ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓ ） 的 Ｍ１９９ 培养基配置 ， 另加 １０％ 胎牛血清 （ ＦＢＳ ）。 ４ ． １７ 　 细胞维持液 ： 用含厄尔平衡盐 （ Ｅａｒｌｅ ’ ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓ ） 的 Ｍ１９９ 培养基配置 ， 另加 ２％ 胎牛血清 （ ＦＢＳ ）。 ４ ． １８ 　 丙酮 ： 分析纯 。 ４ ． １９ 　 无水乙醇 ： 分析纯 ， 使用前预冷到 －２０℃ 。 ４ ． ２０ 　 ０．０１ｍｏｌ ／ ＬＰＢＳ ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．１ 。 ４ ． ２１ 　 固定液 ： 见 Ａ．２ 。 ４ ． ２２ 　 ＰＢＳＴ ： 见 Ａ．３ 。 ４ ． ２３ 　 包被稀释液 ： 见 Ａ．４ 。 ４ ． ２４ 　 底物 ＯＰＤ 溶液 ： 见 Ａ．５ 。 ４ ． ２５ 　 ＣＡＴＢ 溶液