书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 １８６３７ — ２０１８ /G21 /G22 ＧＢ ／ Ｔ１８６３７ — ２００２ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 ／ /G27 /G28 /G22 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E 犜犲犮犺狀犻犮犪犾狊狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀狊犳狅狉犱犻犪犵狀狅狊犻狊狅犳犫狅狏犻狀犲狏犻狉犪犾犱犻犪狉狉犺犲犪 ／ 犿狌犮狅狊犪犾犱犻狊犲犪狊犲 ２０１８  ０９  １７ /G2F /G30 ２０１９  ０４  ０１ /G31 /G32 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2F /G30书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１８６３７ — ２００２ 《 牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病诊断技术 》， 除编辑性修改外 ， 主要技术变化如下 ： ——— 增加了 “ 临床诊断 ” 方法 （ 见第 ４ 章 ）； ——— 增加了 “ 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测 ”（ 见 ５．４ ）。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出 。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中国兽医药品监察所 、 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、 扬州大学 、 中华人民共和国宁夏出入境检验检疫局 、 中华人民共和国天津出入境检验检疫局 、 中国动物卫生与流行病学中心 。 本标准主要起草人 ： 李俊平 、 刘环 、 印春生 、 陶洁 、 郝俊虎 、 蒲静 、 范学政 、 吴华伟 、 孙淼 、 王建华 、 宋建德 、 朱国强 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１８６３７ — ２００２ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １８６３７ — ２０１８ 引 　　 言 　　 牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病 （ ＢｏｖｉｎｅＶｉｒａｌＤｉａｒｒｈｅａ ／ ＭｕｃｏｓａｌＤｉｓｅａｓｅ ， ＢＶＤ ／ ＭＤ ， 简称 ＢＶＤ ）， 是由牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒 （ ＢｏｖｉｎｅＶｉｒａｌＤｉａｒｒｈｅａ ／ ＭｕｃｏｓａｌＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ， ＢＶＤ ／ ＭＤＶ ， 简称 ＢＶＤＶ ） 感染牛引起的以发热 、 粘膜糜烂溃疡 、 白细胞减少 、 腹泻 、 咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病 。 ＢＶＤＶ 在分类学上属黄病毒科 （ 犉犾犪狏犻狏犻狉犻犱犪犲 ）， 瘟病毒属 （ 犘犲狊狋犻狏犻狉狌狊 ）， 是瘟病毒属的代表种 ， 目前国际病毒分类委员会确定的 ＢＶＤＶ 有二个基因型 （ 或种 ）， 分别是 ＢＶＤＶ１ 和 ＢＶＤＶ２ 。 它们与同属的猪瘟病毒 （ ＣｌａｓｓｉｃａｌＳｗｉｎｅＦｅｖｅｒＶｉｒｕｓ ， ＣＳＦＶ ） 及羊边界病病毒 （ ＢｏｒｄｅｒＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ， ＢＤＶ ） 之间存在着结构与抗原相关性 ， 在血清学上有部分交叉反应 。 ＢＶＤＶ１ 引起的疫病呈全球分布 ， 较为常见 ， 而 ＢＶＤＶ２ 引发的疫病不多见 。 二个基因型的病毒均可根据其在培养细胞上能否产生细胞病变而被分为二个生物型 ， 即致细胞病变型 （ Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｔｙｐｅ ， ＣＰ ） 和非致细胞病变型 （ Ｎｏｎｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｔｙｐｅ ， ＮＣＰ ）。 ＮＣＰ 毒株是引起所有感染和发病类型的生物型 ， 而 ＣＰ 毒株主要出现在粘膜病病例 。 目前 ， 该病在世界范围内广泛流行 ， 我国于 １９８３ 年首次分离到了 ＢＶＤＶ 。 近年来 ， 病原学调查表明我国牛 、 羊 、 鹿 、 猪等均不同程度的感染 ＢＶＤＶ ， 该病已严重影响着我国畜牧业的健康发展 。 本标准中所描述的方法均为近几年我国在 ＢＶＤ 诊断过程中常用的方法 ， 包括临床诊断 、 病原学诊断及血清学诊断技术 。 血清学诊断技术为病毒中和试验 。 病原学诊断技术包括病毒分离鉴定和实时荧光 ＲＴＰＣＲ （ ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ ） 检测方法 ， 本标准中的 ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ 检测方法具有 ＢＶＤＶ 特异性 ， 能够同时检测 ＢＶＤＶ１ 和 ＢＶＤＶ２ ， 且能特异区分 ＢＶＤＶ 与 ＣＳＦＶ 。 结合我国动物防疫相关法律 、 法规和政策 ， 本标准能够有效地诊断和监测我国 ＢＶＤ ／ ＭＤ 的发生和流行 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 １８６３７ — ２０１８ 牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病诊断技术规范 １ 　 范围 本标准规定了牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病的流行病学 、 临床症状 、 病理变化等临床诊断 ， 及样品采集与处理 、 病毒分离与鉴定 、 ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ 检测及病毒中和试验等实验室诊断的技术要求和操作规范 。 本标准适用于检测不同样品中的 １ 型和 ２ 型牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒 、 核酸及抗体水平 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１９４３８．１ — ２００４ 　 禽流感病毒通用荧光 ＲＴＰＣＲ 检测方法 ＧＢ１９４８９ 　 实验室 　 生物安全通用要求 ＧＢ ／ Ｔ２７４０１ 　 实验室质量控制规范 　 动物检疫 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＢＴ ： 牛鼻甲骨细胞 （ ＢｏｖｉｎｅＴｕｒｂｉｎａｔｅｃｅｌｌ ） ＢＶＤ ／ ＭＤ ： 牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病 （ ＢｏｖｉｎｅＶｉｒａｌＤｉａｒｒｈｅａ ／ ＭｕｃｏｓａｌＤｉｓｅａｓｅ ） ＢＶＤ ／ ＭＤＶ ： 牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒 （ ＢｏｖｉｎｅＶｉｒａｌＤｉａｒｒｈｅａ ／ ＭｕｃｏｓａｌＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ） ＣＰＥ ： 致细胞病变效应 （ ＣｙｔｏｐａｔｈｉｃＥｆｆｅｃｔ ） ＣＰ ： 致细胞病变型 （ Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｔｙｐｅ ） ｃＲＮＡ ： 互补 ＲＮＡ （ ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＲＮＡ ） Ｃｔ （ Ｃｐ ）： 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数 （ ＣｙｃｌｅＴｈｒｅｓｈｏｌｄ ， ｏｒＣｒｏｓｓｉｎｇＰｏｉｎｔ ） ＤＥＰＣ ： 焦碳酸二乙酯 （ ＤｉｅｔｈｙｌＰｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ） ＦＡＭ ： 羧基荧光素 （ Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ） ＦＢＳ ： 胎牛血清 （ ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ ） ＦＩＴＣ ： 异硫氰酸荧光素 （ ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ） ＭＤＢＫ ： 牛肾继代细胞 （ ＭａｄｉｎＤａｒｂｙＢｏｖｉｎｅＫｉｄｎｅｙｃｅｌｌ ） ＭＥＭ ： 基础培养基 （ ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ ） ＮＣＰ ： 非致细胞病变型 （ Ｎｏｎｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｔｙｐｅ ） ＰＢＳ ： 磷酸盐缓冲液 （ ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ ） ＰＢＳＴ ： 吐温磷酸盐缓冲液 （ ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈＴｗｅｅｎ２０ ） ＰＩ ： 持续性感染 （ ＰｅｒｓｉｓｔｅｎｔＩｎｆｅｃｔｉｏｎ ） ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ ： 实时荧光反转录聚合酶链反应 （ ＲｅａｌｔｉｍｅＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ ） １ 犌犅 ／ 犜 １８６３７ — ２０１８ ＴＣＩＤ ５０ ： 组织半数感染量 （ ＭｅｄｉａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＩｎｆｅｃｔｉｖｅＤｏｓｅ ） ４ 　 临床诊断 ４ ． １ 　 流行病学 ＢＶＤＶ 可感染各种年龄的牛 ， 青年牛可发生急性感染 ， 怀孕牛极易发生垂直传播 。 急性感染的牛病毒血症持续时间较短 ， 表现为一过性排毒 ， 而且排毒量低 ， 在疫病的传播中不起主要作用 。 怀孕牛感染可引起流产 、 胚胎吸收 、 死胎 、 先天性缺陷或出生牛犊的持续性感染 （ ＰＩ ） 等 。 怀孕 １２０ 天之前先天性感染的胎牛 ， 出生后往往表现为 ＰＩ ， 它们可终身带毒及排毒 ， 是 ＢＶＤＶ 的主要储存宿主和传播来源 。 ＢＶＤＶ 的水平传播导致急性感染 ， 主要发生在同牛群内或临近牛群间的相互感染 ， 其中易感牛与 ＰＩ 牛直接接触是 ＢＶＤＶ 水平传播的主要途径 。 ４ ． ２ 　 临床症状 ４ ． ２ ． １ 　 亚临床感染 在免疫机能健全 、 血清抗体阴性的牛发生 ＢＶＤＶ 感染时 ， ７０％ ～ ９０％ 的牛不表现出明显的眼观临床症状 ， 即处于亚临床感染状态 。 可导致温和型发热 、 白细胞减少症和血清中和抗体的产生 ， 对泌乳期奶牛可导致产奶量降低 。 ４ ． ２ ． ２ 　 急性感染 急性 ＢＶＤＶ 感染通常发生在免疫机能健全的青年牛群 ， 以 ６ 月龄 ～ ２４ 月龄的血清抗体阴性牛常见 。 临床症状包括不同程度的高热 、 厌食 、 精神沉郁 、 白细胞减少 、 眼和鼻腔分泌物增加 、 口腔溃疡 、 口腔脓包和出血 、 腹泻 、 呼吸