书 书 书犐犆犛 ６５ ． １５０ 犅 ５０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １８６５４ ． １３ — ２００８ 养殖鱼类种质检验 第 １３ 部分 ： 同工酶电泳分析 犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀狅犳犵犲狉犿狆犾犪狊犿犳狅狉犮狌犾狋狌狉犲犱犳犻狊犺犲狊 — 犘犪狉狋 １３ ： 犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犻狊狅狕狔犿犲犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊 ２００８  ０６  ２７ 发布 ２００８  １０  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４ 《 养殖鱼类种质检验 》 分为下列部分 ： ——— 第 １ 部分 ： 检验规则 ； ——— 第 ２ 部分 ： 抽样方法 ； ——— 第 ３ 部分 ： 性状测定 ； ——— 第 ４ 部分 ： 年龄与生长的测定 ； ——— 第 ５ 部分 ： 食性分析 ； ——— 第 ６ 部分 ： 繁殖性能的测定 ； ——— 第 ７ 部分 ： 生态特性分析 ； ——— 第 ８ 部分 ： 耗氧率与临界窒息点的测定 ； ——— 第 ９ 部分 ： 含肉率测定 ； ——— 第 １０ 部分 ： 肌肉营养成分的测定 ； ——— 第 １１ 部分 ： 肌肉中主要氨基酸含量的测定 ； ——— 第 １２ 部分 ： 染色体组型分析 ； ——— 第 １３ 部分 ： 同工酶电泳分析 ； ——— 第 １４ 部分 ： ＤＮＡ 含量的测定 ； ——— 第 １５ 部分 ： ＲＡＰＤ 分析 ； …… 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４ 的第 １３ 部分 。 本部分的附录 Ａ 为规范性附录 。 本部分由中华人民共和国农业部提出 。 本部分由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口 。 本部分起草单位 ： 上海水产大学 、 中国水产科学研究院长江水产研究所 。 本部分主要起草人 ： 李思发 、 赵金良 、 徐忠法 、 蔡完其 、 邹曙明 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １８６５４ ． １３ — ２００８ 养殖鱼类种质检验 第 １３ 部分 ： 同工酶电泳分析 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４ 的本部分规定了鱼类同工酶聚丙烯酰胺凝胶水平电泳分析的试剂与材料 、 仪器和设 备 、 抽样 、 分析步骤和结果判定 。 本部分适用于鱼类同工酶电泳分析 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４ 的本部分的引用而成为本部分的条款 。 凡是注日期的引用文 件 ， 其随后所有的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本部分 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本 部分 。 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１ — ２００２ 　 养殖鱼类种质检验 　 第 １ 部分 ： 检验规则 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．２ 　 养殖鱼类种质检验 　 第 ２ 部分 ： 抽样方法 ３ 　 原理 同工酶为该酶基因产物的表现型 ， 根据其所带电荷的不同和分子大小 、 形状的不同 ， 在电场和凝胶 中出现各同工酶组分不同的迁移率 ， 经催化 、 染色 、 扫描 ， 根据酶带迁移距离 、 数目及吸收强度进行分析 比较 ， 判定鱼类物种 、 种群的遗传特性 。 ４ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。 ４ ． １ 　 丙烯酰胺 （ Ａｒｃ ）。 ４ ． ２ 　 犖′ ， 犖′  亚甲基双丙烯酰胺或甲叉双丙烯酰胺 （ Ｂｉｓ ）。 ４ ． ３ 　 四甲基乙二胺 （ ＴＥＭＥＤ ）。 ４ ． ４ 　 过硫酸胺 。 ４ ． ５ 　 三羟甲基氨基甲烷 （ Ｔｒｉｓ ）。 ４ ． ６ 　 柠檬酸 。 ４ ． ７ 　 乙二胺四乙酸 （ ＥＤＴＡ ）。 ４ ． ８ 　 硼酸 。 ４ ． ９ 　 Ｌ 组氨酸 。 ４ ． １０ 　 乳酸 。 ４ ． １１ 　 ＤＬ 苹果酸 。 ４ ． １２ 　 α  磷酸甘油钠 。 ４ ． １３ 　 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ ）。 ４ ． １４ 　 二个结晶水的磷酸二氢钠 （ ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ）。 ４ ． １５ 　 辅酶 Ⅰ （ ＮＡＤ ）。 ４ ． １６ 　 辅酶 Ⅱ （ ＮＡＤＰ ）。 １ 犌犅 ／ 犜 １８６５４ ． １３ — ２００８ ４ ． １７ 　 吩嗪甲酯硫酸盐 （ ＰＭＳ ）。 ４ ． １８ 　 氯化硝基四氮唑蓝 （ ＮＢＴ ）。 ４ ． １９ 　 山梨醇 。 ４ ． ２０ 　 ＤＬ 异柠檬酸三钠 。 ４ ． ２１ 　 ６ 磷酸葡萄糖酸钠 。 ４ ． ２２ 　 α  乙酸萘酯 。 ４ ． ２３ 　 β  乙酸萘酯 。 ４ ． ２４ 　 丙酮 。 ４ ． ２５ 　 坚牢蓝 ＲＲ 盐 。 ４ ． ２６ 　 氨基黑 １０Ｂ 。 ４ ． ２７ 　 ９５％ 乙醇 。 ４ ． ２８ 　 盐酸 （ ＨＣｌ ）。 ４ ． ２９ 　 氢氧化钠 （ ＮａＯＨ ）。 ４ ． ３０ 　 固定液 ： ３ 份乙醇 ， 加 １ 份冰乙酸 ， 加 １ 份甘油 ， 加 ５ 份蒸馏水 ， 混合均匀 。 ４ ． ３１ 　 ＴＣ 制胶缓冲液 ： 三羟甲基氨基甲烷 ３．０２８５ｇ ， 用柠檬酸调至 ｐＨ８．０ ， 蒸馏水定容至 １Ｌ 。 ４ ． ３２ 　 ＥＢＴ 制胶缓冲液 ： 三羟甲基氨基甲烷 ５．４５１３ｇ 、 ＥＤＴＡ０．２９２２ｇ ， 用硼酸调节至 ｐＨ８．６ ， 蒸馏水 定容至 １Ｌ 。 ４ ． ３３ 　 ＨＣ 制胶缓冲液 ： 组氨酸 １．９３９５ｇ 、 柠檬酸 ２１．０１４ｇ ， 用 ５％ＮａＯＨ 调至 ｐＨ８．２ ， 蒸馏水定容至 １Ｌ 。 ４ ． ３４ 　 ＴＣ 电极缓冲液 ： 三羟甲基氨基甲烷 ４８．６５ｇ ， 用柠檬酸调 ｐＨ 至 ８．０ ， 蒸馏水稀释至 １０Ｌ 。 ４ ． ３５ 　 ＥＢＴ 电极制胶缓冲液 ： 三羟甲基氨基甲烷 ６５．４ｇ 、 ＥＤＴＡ３．５１ｇ ， 用硼酸调至 ｐＨ８．６ ， 蒸馏水稀 释至 １５Ｌ 。 ４ ． ３６ 　 ＨＣ 电极制胶缓冲液 ： 组氨酸 １．９３９５ｇ 、 柠檬酸 ２１．０１４ｇ ， 用 ５％ＮａＯＨ 调 ｐＨ 至 ８．５ ， 蒸馏水稀 释至 １０Ｌ 。 ４ ． ３７ 　 Ａｒｃ．Ｂｉｓ 液 ： 丙烯酰胺 ９８ｇ 、 犖′ ， 犖′  亚甲基双丙烯酰胺 ２ｇ ， 用蒸馏水溶解并定容到 ５００ｍＬ 。 ４ ． ３８ 　 ２５％ＴＥＭＥＤ ： ＴＥＭＥＤ２５ｍＬ ， 加入 ７５ｍＬ 蒸馏水 。 ４ ． ３９ 　 １００ｍｇ ／ ｍＬ 过硫酸胺 ： 过硫酸胺 ０．１ｇ ， 溶解于 １ｍＬ 蒸馏水中 。 ４ ． ４０ 　 ４％ 聚丙烯酰胺凝胶 ： Ａｒｃ．Ｂｉｓ 液 １３．２ｍＬ 、 制胶缓冲液 １４．７ｍＬ 、 蒸馏水 ３７．５ｍＬ 、 ２５％ ＴＥＭＥＤ０．３ｍＬ 、 １０％ 过硫酸胺 ０．６ｍＬ ， 混匀后 ， 立即灌注到凝胶模具中 ， 聚合反应结束后 ， 取出凝胶 ， 放在保湿盒内备用 。 ４ ． ４１ 　 １．５ｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ （ ｐＨ８．０ ）： 三羟甲基氨基甲烷 １８１．７１ｇ ， 用 ＨＣｌ 调至 ｐＨ８．０ ， 蒸馏水稀释至 １Ｌ 。 ４ ． ４２ 　 １．５ｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ （ ｐＨ９．５ ）： 三羟甲基氨基甲烷 １８１．７１ｇ ， 用 ＨＣｌ 调至 ｐＨ９．５ ， 蒸馏水稀释至 １Ｌ 。 ４ ． ４３ 　 ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸缓冲液 ： ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ５１．６ｇ 、 Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ １４．２ｇ ， 蒸馏水溶解并定容至 １Ｌ 。 ４ ． ４４ 　 染色液 ： 几种常见同工酶染色液的配制方法见附录 Ａ 。 ５ 　 仪器与设备 ５ ． １ 　 微量匀浆机 ： 转速 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ ． ２ 　 高速冷冻离心机 ： 转速 １５０００ｒ ／ ｍｉｎ 以上 ， 冷冻温度为 ４℃ 。 ５ ． ３ 　 多用电泳仪 。 ５ ． ４ 　 激光扫描仪 。 ５ ． ５ 　 ｐＨ 计 ： 读数值 ０．０１ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １８６５４ ． １３ — ２００８ ５ ． ６ 　 微量加样注射器 。 ５ ． ７ 　 制胶模具 。 ５ ． ８ 　 染色缸 。 ５ ． ９ 　 低温冰箱 ： 冰室温度在 －３０℃ 以下 。 ５ ． １０ 　 恒温培养箱 。 ５ ． １１ 　 分析天平 ： 感量为 ０．０００１ｇ 。 ５ ． １２ 　 电子天平 ： 感量为 ０．１ｇ 。 ５ ． １３ 　 照相机 。 ６ 　 抽样 ６ ． １ 　 活体样品鱼的抽样 按 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．２ 的规定执行 ， 样品鱼数量为 ３０ 尾以上 。 ６ ． ２ 　 取样 活体解剖样品鱼 ， 按被检鱼类种质标准所规定的组织取 １ｇ ～ ２ｇ 试样 ， 放入编号的小塑料袋中 ； 对 于血液试样用注射器从鱼的尾动脉抽血 ， 分离出血清 。 样品均需置于低温冰箱中保存备用 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 分析样品的制备 取 ０．３ｇ 样品 ， 以 １ 份试样加入 ３ 份体积的 ０．３％ＮＡＤ 液 ， 于匀浆机中以 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 匀浆 ２ｍｉｎ ， 粉碎组织 。 用吸管将匀浆后的样品移入指管中 ， 在冷冻离心机中以 １５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心直至上清 液澄清 ， 以上操作均在 ４℃ 低温下进行 。 制备后样品于冰箱中暂存或直接电泳 。 ７ ． ２ 　 凝胶制备 凝胶制备按试剂和材料中 ４．４０ 的规定执