书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１３１９ — ２００７ 动物源食品中阿维菌素类药物 残留的测定 　 酶联免疫吸附法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪狏犲狉犿犲犮狋犻狀狊狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀 — 犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔 ２００７  １０  ２９ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业大学 、 中国检验检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 沈建忠 、 史为民 、 万宇平 、 何方洋 、 吴聪明 、 张素霞 、 冯才伟 、 彭涛 、 国伟 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１３１９ — ２００７ 动物源食品中阿维菌素类药物 残留的测定 　 酶联免疫吸附法 １ 　 范围 本标准规定了动物源食品中阿维菌素类药物残留量的酶联免疫吸附测定法 。 本标准适用于牛肉和牛肝中阿维菌素 、 伊维菌素和埃普利诺菌素残留量的测定 。 本标准的方法检测限 ： 阿维菌素类药物在牛肝组织和牛肉组织中的检测限均为 ２ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 原理 采用间接竞争 ＥＬＩＳＡ 方法 ， 在微孔条上包被偶联抗原 ， 试样中残留的阿维菌素类药物与酶标板上 的偶联抗原竞争阿维菌素抗体 ， 加入酶标记的抗体后 ， 显色剂显色 ， 终止液终止反应 。 用酶标仪在 ４５０ｎｍ 处测定吸光度 ， 吸光值与阿维菌素类药物残留量成负相关 ， 与标准曲线比较即可得出阿维菌素 类药物残留含量 。 ４ 　 试剂和材料 ４ ． １ 　 阿维菌素类药物试剂盒 ４ ． １ ． １ 　 ９６ 孔板 （ １２ 条 ×８ 孔 ） 包被有阿维菌素偶联抗原 。 ４ ． １ ． ２ 　 阿维菌素标准溶液 （ 至少有 ５ 个倍比稀释浓度水平 ， 外加 １ 个空白 ）。 ４ ． １ ． ３ 　 阿维菌素抗体溶液 。 ４ ． １ ． ４ 　 过氧化物酶标记物 。 ４ ． １ ． ５ 　 底物显色溶液 Ａ 液 ： 过氧化尿素 。 ４ ． １ ． ６ 　 底物显色溶液 Ｂ 液 ： 四甲基联苯胺 。 ４ ． １ ． ７ 　 反应终止液 ： １ｍｏｌ ／ Ｌ 硫酸 。 ４ ． １ ． ８ 　 缓冲液 （ ２ 倍浓缩液 ）。 ４ ． １ ． ９ 　 洗涤液 （ ２０ 倍浓缩液 ）。 ４ ． ２ 　 乙腈 、 正己烷 、 无水硫酸钠 （ 分析纯 ）。 ４ ． ３ 　 碱性氧化铝柱 ＳｅｐＰａｋＶａｃ１２ｃｃ （ ２ｇ ）。 ４ ． ４ 　 水 ： ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． ５ 　 缓冲液工作液 ： 用水将 ２ 倍的浓缩缓冲液按 １∶１ 体积比进行稀释 （ １ 份 ２ 倍浓缩缓冲液 ＋１ 份 水 ）， 用于溶解干燥的残留物 ， 缓冲液工作液在 ４℃ 可保存一个月 。 ４ ． ６ 　 洗涤液工作液 ： 用水将 ２０ 倍的浓缩洗涤液按 １∶１９ 体积比进行稀释 （ １ 份 ２０ 倍浓缩洗涤液 ＋１９ 份水 ）， 用于酶标板的洗涤 ， 洗涤工作液在 ４℃ 可保存一个月 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１３１９ — ２００７ ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 酶标仪 （ 配备 ４５０ｎｍ 滤光片 ）。 ５ ． ２ 　 超声波清洗器 。 ５ ． ３ 　 离心机 。 ５ ． ４ 　 氮气吹干仪 。 ５ ． ５ 　 匀浆机 。 ５ ． ６ 　 振荡器 。 ５ ． ７ 　 涡旋式混合器 。 ５ ． ８ 　 微量移液器 ： 单道 ２０ μ Ｌ 、 ５０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ， 多道 ５０ μ Ｌ ～ ３００ μ Ｌ 可调 。 ６ 　 试样制备与保存 取新鲜或解冻的动物组织 ， 剪碎 ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ 匀浆 １ｍｉｎ 。 －２０℃ 下保存 。 ７ 　 试样测定 ７ ． １ 　 提取 称取牛肉 、 牛肝试样 ３．０ｇ±０．０５ｇ 于 ５０ｍＬ 聚苯乙烯离心管中 ， 加 ９ｍＬ 乙腈 、 ３ｍＬ 正己烷 ， 置于 振荡器上振荡 １０ｍｉｎ ， 加 ３ｇ 无水硫酸钠 ， 再振荡 １０ｍｉｎ ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 以上 ， １５℃ 离心 １０ｍｉｎ ， 去除上层 正己烷 ， 取下层 ４．０ｍＬ 提取液备用 。 称取 ３ｇ 无水硫酸钠平铺在碱性氧化铝柱 ＳｅｐＰａｋＶａｃ 上 ， 加 １０ｍＬ 乙腈洗柱 ， 再加 ４．０ｍＬ 提取 液 ， 开始收集滤液 ， 待提取液流干后 ， 再加入 ４ｍＬ 乙腈清洗柱子 ， 合并洗液和滤液至 １０ｍＬ 干净的玻璃 试管中 ， 于 ５０℃ ～ ６０℃ 水浴氮气流下吹干 。 取 １．０ｍＬ 缓冲液工作液溶解干燥的残留物 ， 涡动 １ｍｉｎ ， 超声 １０ｍｉｎ ， 涡动 １ｍｉｎ 。 取溶解后的样 品液 １００ μ Ｌ 加入 １００ μ Ｌ 缓冲液工作液 ， 充分混合 ， 取 ２０ μ Ｌ 用于分析 。 ７ ． ２ 　 测定 使用前将试剂盒在室温 （ １９℃ ～ ２５℃ ） 下放置 １ｈ ～ ２ｈ 。 ７ ． ２ ． １ 　 将标准和试样 （ 至少按双平行实验计算 ） 所有数量的孔条插入微孔架 ， 记录标准和试样的位置 。 ７ ． ２ ． ２ 　 加 ２０ μ Ｌ 系列标准溶液 （ ４．１．２ ） 或处理好的试样溶液到各自的微孔中 。 标准和试样至少做两个 平行试验 。 ７ ． ２ ． ３ 　 加抗体工作液 （ ４．１．３ ） ８０ μ Ｌ 到每一个微孔中 ， 充分混合 ， 于 ３７℃ 恒温箱中孵育 ３０ｍｉｎ 。 ７ ． ２ ． ４ 　 倒出孔中液体 ， 将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体 。 用 ２５０ μ Ｌ 洗涤液 工作液充入孔中 ， 再次倒掉微孔中液体 ， 再重复操作两遍以上 （ 或用洗板机洗涤 ）。 ７ ． ２ ． ５ 　 加 １００ μ Ｌ 过氧化物酶标记物 （ ４．１．４ ）， ３７℃ 恒温箱中孵育 ３０ｍｉｎ 。 ７ ． ２ ． ６ 　 倒出孔中液体 ， 将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体 。 用 ２５０ μ Ｌ 洗涤液 工作液充入孔中 ， 再次倒掉微孔中液体 ， 再重复操作两遍以上 （ 或用洗板机洗涤 ）。 ７ ． ２ ． ７ 　 加 ５０ μ Ｌ 底物显色液 Ａ 液 （ ４．１．５ ） 和 ５０ μ Ｌ 底物显色液 Ｂ 液 （ ４．１．６ ）， 混合并在 ３７℃ 恒温箱避 光显色 １５ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ 。 ７ ． ２ ． ８ 　 加 ５０ μ Ｌ 反应终止液 （ ４．１．７ ）， 轻轻振荡混匀 ， 用酶标仪在 ４５０ｎｍ 处测量吸光度值 。 ８ 　 结果计算 用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算 ， 见式 （ １ ）： 犃 ｒ ＝ 犅 犅 ０ × １００％ …………………………（ １ ） ２ 犌犅 ／ 犜 ２１３１９ — ２００７ 式中 ： 犃 ｒ ——— 相对吸光度值 ， ％ ； 犅 ——— 标准 （ 试样 ） 溶液的吸光度值 ； 犅 ０ ——— 空白 （ 浓度为 ０ 的标准溶液 ） 的吸光度值 。 　　 将计算的相对吸光度值 （ ％ ） 对应阿维菌素 （ μ ｇ ／ Ｌ ） 的自然对数作半对数坐标系统曲线图 ， 对应的试 样浓度可从校正曲线算出 ， 见式 （ ２ ）： 犡 ＝ 犃 × 犳 犿 × １０００ …………………………（ ２ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中阿维菌素类的含量 ， 单位为微克每千克 （ μ ｇ ／ ｋｇ ）； 犃 ——— 试样的相对吸光度值 （ ％ ） 对应的阿维菌素类含量 ， 单位为微克每升 （ μ ｇ ／ Ｌ ）； 犳 ——— 试样稀释倍数 ； 犿 ——— 试样的取样量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 计算结果表示到小数点后两位 。 阳性结果应用确证法确证 。 ９ 　 交叉反应 阿维菌素 ： １００％ ； 埃普利诺菌素 ： １３０％ ； 伊维菌素 ： ３３％ ； 多拉菌素 ： ５％ ； 泰乐菌素 ： ＜ ０．１％ ； 替米考星 ： ＜ ０．１％ 。 １０ 　 精密度 本方法的批内变异系数 ≤ ３０％ ， 批间变异系数 ≤ ４５％ 。 犌犅 ／ 犜 ２１３１９ — ２００７