书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１５４２ — ２００８ 饲料中恩拉霉素的测定 　 微生物学法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犲狀狉犪犿狔犮犻狀犻狀犳犲犲犱狊 — 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犿犲狋犺狅犱 ２００８  ０４  ０９ 发布 ２００８  ０７  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为规范性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 上海市兽药饲料监察所 。 本标准主要起草人 ： 顾欣 、 蔡金华 、 刘雅妮 、 沈富林 、 王蓓 、 黄士新 、 金凌艳 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１５４２ — ２００８ 饲料中恩拉霉素的测定 　 微生物学法 １ 　 范围 本标准规定了饲料中恩拉霉素的微生物学测定方法 。 本标准适用于配合饲料 、 浓缩饲料 、 预混合饲料中恩拉霉素的含量测定 。 本方法测定饲料中恩拉霉素的定量限为 ０．５ｍｇ ／ ｋｇ （ ５００Ｕ ／ ｋｇ ）。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 （ ＩＳＯ６４９８ ： １９９８ ， ＩＤＴ ） 中华人民共和国兽药典 （ ２００５ 年版一部 ） ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 恩拉霉素效价单位 　 狆狅狋犲狀犮狔狌狀犻狋狅犳犲狀狉犪犿狔犮犻狀 微生物学法测定的恩拉霉素生物活性单位用 Ｕ 表示 。 １ｍｇ 恩拉霉素相当于 １０００Ｕ 。 ４ 　 原理 用酸性甲醇溶液提取试样中的恩拉霉素 ， 然后提取液用大孔吸附树脂对恩拉霉素吸附 、 洗脱 ， 除去 饲料中的干扰物质 。 利用标准溶液中恩拉霉素浓度的对数与其对敏感微生物生长抑制而产生的抑菌圈 的直径成正比关系的原理制作标准曲线 ， 根据试样液中恩拉霉素产生抑菌圈的大小来测定饲料中恩拉 霉素的含量 。 ５ 　 试剂和材料 除另有规定外 ， 在分析中使用的试剂均为分析纯 ， 水为蒸馏水或去离子水 ， 应符 合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ 规定的三级用水要求 。 ５ ． １ 　 甲醇溶液 甲醇  水 （ １＋１ ）。 ５ ． ２ 　 盐酸溶液 取盐酸 ９ｍＬ ， 加水至 １０００ｍＬ ， 混匀 。 ５ ． ３ 　 氢氧化钠溶液 取澄清的氢氧化钠饱和溶液 １１２ｍＬ ， 加水至 １０００ｍＬ ， 混匀 。 ５ ． ４ 　 洗涤液 甲醇溶液 （ ５．１ ）， 用氢氧化钠溶液 （ ５．３ ） 调节 ｐＨ 值至 ８ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１５４２ — ２００８ ５ ． ５ 　 提取液 甲醇溶液 （ ５．１ ）， 用盐酸溶液 （ ５．２ ） 调节 ｐＨ 值至 ３ 。 ５ ． ６ 　 洗脱液 甲醇  水 （ ７＋３ ）， 用盐酸溶液 （ ５．２ ） 调节 ｐＨ 值至 ３ 。 ５ ． ７ 　 灭菌水 按附录 Ａ 的规定制备 。 ５ ． ８ 　 磷酸盐缓冲液 （ 狆犎 ６ ． ０ ） 按附录 Ａ 的规定制备 。 ５ ． ９ 　 大孔吸附树脂 多孔苯乙烯  二乙烯苯聚合物树脂 （ ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＸＡＤ２ ， 粒度 ： ２０ 目 ～ ６０ 目 ， 平均孔径 ： ９ｎｍ ， 比表面 积 ： ３００ｍ ２ ／ ｇ ， 孔容积 ： ０．６５ｍＬ ／ ｇ ， 骨架密度 ： １．０８ｇ ／ ｍＬ ， ２５℃ ）。 可使用参数相同的同类产品 。 将准备使用的大孔吸附树脂浸入足量的甲醇中 （ 液面高出树脂层 ２ｃｍ ～ ５ｃｍ ）， 轻轻地搅拌 ， 使充 分混合 ， 放置 １５ｍｉｎ ， 小心地尽量倾去上层甲醇液 ， 加入足量的水 ， 搅拌混合 ， 放置 １０ｍｉｎ ， 备用 。 ５ ． １０ 　 大孔吸附树脂层析柱 将预处理过的大孔吸附树脂 （ ５．９ ） 湿法装入层析柱中 （ 高 ２０ｃｍ ， 内径 １０ｍｍ ）， 使柱床高度为 １５ｃｍ ， 使用 ２５ｍＬ 洗涤液 （ ５．４ ） 以 ０．４ｍＬ ／ ｍｉｎ 流速过柱 ， 平衡后待用 。 ５ ． １１ 　 恩拉霉素标准溶液 ５ ． １１ ． １ 　 恩拉霉素标准贮备溶液 称取恩拉霉素标准品 （ 效价单位不小于 ９００Ｕ ／ ｍｇ ） 适量 ， 精确至 ０．１ｍｇ ， 用甲醇溶液 （ ５．１ ） 溶解并 稀释成含恩拉霉素 １０００Ｕ ／ ｍＬ 的溶液 ， 在 ０℃ ～ ４℃ 可保存 ７ｄ 。 ５ ． １１ ． ２ 　 恩拉霉素标准工作溶液 精确量取恩拉霉素标准贮备溶液 （ ５．１１．１ ）， 用 ｐＨ６．０ 磷酸盐缓冲液 （ ５．８ ） 稀释成 ０．４Ｕ ／ ｍＬ 、 ０．８Ｕ ／ ｍＬ 、 １．６Ｕ ／ ｍＬ 、 ３．２Ｕ ／ ｍＬ 、 ６．４Ｕ ／ ｍＬ 浓度的标准工作溶液 。 以 １．６Ｕ ／ ｍＬ 为中心浓度标准 工作溶液 。 ５ ． １２ 　 培养基 Ⅰ 按附录 Ａ 的规定制备 。 ５ ． １３ 　 培养基 Ⅱ 按附录 Ａ 的规定制备 。 ５ ． １４ 　 试验菌种 枯草芽孢杆菌 （ 犅犪犮犻犾犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊 ）［ ＣＭＣＣ （ Ｂ ） ６３５０１ 或 ＣＶＣＣ７１７ ］。 ５ ． １５ 　 菌悬液 取枯草芽孢杆菌 （ ５．１４ ） 的新鲜培养物接种于培养基 Ⅰ （ ５．１２ ） 内 ， 在 ３５℃ ～ ３７℃ 培养 ７ｄ ， 用灭菌 水将芽孢洗下 ， 在 ６５℃ 水浴加热 ３０ｍｉｎ 后 ， 于 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３０ｍｉｎ ， 弃去上层液 ， 加入足量的灭菌 水使沉淀物重悬浮 ， 离心 ， 重复洗涤三次 ， 弃去洗液 ， 最后加入适量的灭菌水制成菌悬液 ， 此菌悬液在 ０℃ ～ ４℃ 可保存 ６ 个月 。 ５ ． １６ 　 双碟的制备 取培养基 Ⅱ （ ５．１３ ） 加热融化 ， 冷却至 ６０℃ ， 加入适量的菌悬液 （ 以 １．６Ｕ ／ ｍＬ 中心浓度标准工作溶 液产生的抑菌圈直径不小于 １６ｍｍ 为宜 ）， 摇匀 。 每个双碟加入 １０ｍＬ 含菌培养基 ， 均匀摊布 ， 放置于 水平操作台上冷却 ， 待培养基凝固后 ， 在每个双碟内半径为 ２．８ｃｍ 的圆周上等距离放置 ６ 个已灭菌的 不锈钢小管 。 ６ 　 仪器与设备 ６ ． １ 　 分析天平 ： 感量 ０．０００１ｇ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１５４２ — ２００８ ６ ． ２ 　 天平 ： 感量 ０．０１ｇ 。 ６ ． ３ 　 振荡器 ： 往复式 。 ６ ． ４ 　 离心机 。 ６ ． ５ 　 旋转真空蒸发器 。 ６ ． ６ 　 电热恒温水浴锅 ： 温度波动 ±１℃ 。 ６ ． ７ 　 平底双碟 ： 直径为 ９０ｍｍ ， 高 １６ｍｍ ～ １７ｍｍ ， 符合 《 中华人民共和国兽药典 》 ２００５ 年版一部的 要求 。 ６ ． ８ 　 陶瓦盖 。 ６ ． ９ 　 不锈钢小管 ： 高 １０．０ｍｍ±０．１ｍｍ ， 外径 ８．０ｍｍ±０．１ｍｍ ， 内径 ６．０ｍｍ±０．１ｍｍ ， 符合 《 中华 人民共和国兽药典 》 ２００５ 年版一部的要求 。 ６ ． １０ 　 恒温培养箱 ： 温度波动 ±１℃ 。 ６ ． １１ 　 高压灭菌锅 。 ６ ． １２ 　 可调式微量移液器 ： ２００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 。 ６ ． １３ 　 游标卡尺 （ 精度 ０．０２ｍｍ ） 或抑菌圈测定仪 。 ７ 　 试样的制备 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 制备试样 ， 经粉碎后全部通过 １ｍｍ 孔筛 ， 混匀 ， 装入密闭容器中备用 。 ８ 　 含量测定 ８ ． １ 　 标准曲线的制备 取制备好的双碟 （ ５．１６ ） 平均分为 ５ 组 ， 标准工作溶液 （ ５．１１．２ ） 每一个浓度为一组 ， 每组不少于 ３ 个 碟子 。 每个双碟的 ６ 个不锈钢小管中 ， 间位的 ３ 个使用可调式微量移液器滴加 ２００ μ Ｌ 中心浓度标准工 作溶液 （ ５．１１．２ ）， 另外 ３ 个滴加 ２００ μ Ｌ 该组浓度标准工作溶液 ， 将双碟小心移至恒温培养箱中 ， 盖上陶 瓦盖 ， 于 ３６℃ ～ ３７℃ 培养 １６ｈ ～ １８ｈ 。 测量各组中心浓度标准工作溶液和该组标准工作溶液的抑菌圈直径 ， 分别计算平均值 ， 再计算所有 双碟中心浓度标准工作溶液抑菌圈直径的总平均值 ， 作为修正值 。 各浓度组的抑菌圈直径按式 （ １ ） 修正 ： 犃 ａ ＝ 犅 ａ － 犅 ＋ 犃 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犃 ａ ——— 该浓度标准工作溶液被修正后的抑菌圈直径 ； 犅 ａ ——— 修正值 ； 犅 ——— 该浓度组中心浓度标准工作溶液所至抑菌圈直径读数平均值 ； 犃 ——— 该浓度标准工作溶液抑菌圈直径读数平均值 。 以各组溶液浓度的对数与该组溶液被修正后的抑菌圈直径作线性回归 ， 求出回归方程 。 相关系数 狉 应不小于 ０．９９ 。 ８ ． ２ 　 试样溶液的制备 ８ ． ２ ． １ 　 准确称取 １０ｇ 的试样 ， 精确至