书 书 书犐犆犛 １１ ． １００ ； ７１ ． ０４０ ． ９９ 犖 ５３ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１６３７ — ２００８ 冠状病毒透射电子显微镜 形态学鉴定方法 犕犲狋犺狅犱狅犳犿狅狉狆犺狅犾狅犵犻犮犪犾犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮狅狉狅狀犪狏犻狉狌狊 犫狔狌狊犻狀犵狋狉犪狀狊犿犻狊狊犻狅狀犲犾犲犮狋狉狅狀犿犻犮狉狅狊犮狅狆狔 ２００８  ０４  １１ 发布 ２００８  １０  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 和附录 Ｂ 为资料性附录 。 本标准由全国微束分析标准化技术委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国科学院地质与地球物理研究所 、 中国人民解放军军事医学科学院基础医学 研究所 、 国家生物医学分析中心 、 中国医学科学院基础医学研究所 、 中国人民解放军第二军医大学基础 部 、 复旦大学上海医学院 、 广州兴世元生物光子微技术有限公司 。 本标准主要起草人 ： 陈德蕙 、 曾荣树 、 杨怡 、 刘世德 、 杨勇骥 、 俞彰 、 毕舒 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１６３７ — ２００８ 引 　　 言 　　 随着电子显微学 、 病毒体外培养和病毒分离纯化技术的发展 ， 有关病毒形态结构 、 化学成分 、 基因构 成以及其生物学特性等方面的知识日益增长 。 根据透射电子显微镜下病毒形态结构特征 ： 病毒粒子的 形状和大小 ， 衣壳的对称性 （ 是立体对称还是螺旋对称 ） 和大小 ， 壳微粒的数目和排列 ， 核衣壳在宿主细 胞内复制和组装的部位 ， 有无包膜 ， 包膜表面纤突的大小 、 形状及间距以及有包膜病毒芽生成熟的部位 等 ， 并结合病毒的核酸和蛋白质的生物学以及分子生物学特性对病毒进行分类和命名 。 目前已知对人 类致病的病毒至少涉及 ２２ 个科 （ Ｆａｍｉｌｙ ） 和两个未归类的病毒属 （ Ｇｅｎｕｓ ）。 在病毒的命名和分类学中 病毒的形态特征是首要的指征 。 实践证明 ， 根据病毒的形态和形态发生学特征可以应用电子显微术准 确地鉴定病毒到科 。 为了正确指导人类病毒性传染病病毒病原的诊断和鉴定工作 ， 有必要制定与人类 疾病相关病毒的透射电子显微镜形态学分析鉴定方法的国家标准 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ２１６３７ — ２００８ 冠状病毒透射电子显微镜 形态学鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了应用透射电子显微镜观察与鉴定冠状病毒的方法 、 要求和冠状病毒的形态和形态发 生学特征 （ 参见附录 Ａ 、 附录 Ｂ ）。 本标准适用于利用透射电子显微镜对冠状病毒形态的鉴定 。 ２ 　 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ２ ． １ 病毒 　 狏犻狉狌狊 一类比较原始的 、 仅含一种核酸 （ ＤＮＡ 或 ＲＮＡ ）、 能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物 。 ２ ． ２ 病毒粒子 　 狏犻狉犻狅狀 复制 、 装配完善的成熟病毒颗粒 。 ２ ． ３ 核衣壳 　 狀狌犮犾犲狅犮犪狆狊犻犱 由病毒的蛋白质衣壳和核酸中心组成 ， 有立体对称和螺旋对称两种 。 ２ ． ４ 核衣壳螺旋对称 　 犺犲犾犻犮犪犾狊狔犿犿犲狋狉狔狅犳狀狌犮犾犲狅犮犪狆狊犻犱 蛋白质亚基被复在缠绕的核酸外面 ， 沿中心轴呈螺旋排列 ， 形成高度有序 、 对称的稳定结构 。 ２ ． ５ 包膜 　 犲狀狏犲犾狅狆犲 在病毒核衣壳外面 ， 由脂蛋白和黏蛋白组成的双层脂质膜 。 ２ ． ６ 表面突起或称纤突 　 狊狌狉犳犪犮犲狆狉狅犼犲犮狋犻狅狀 ， 狊狆犻犽犲狅狉狆犲狆犾狅犿犲狉 包膜的外层由糖蛋白构成的穗状突起 ， 具有抗原性 。 ２ ． ７ 负染 　 狀犲犵犪狋犻狏犲狊狋犪犻狀 利用高密度重金属盐 （ 如磷钨酸 、 醋酸铀等 ） 染液 ， 将微小的病毒包围起来 ， 在暗背景上显示病毒的 微细结构 。 ２ ． ８ 超薄切片 　 狌犾狋狉犪狋犺犻狀狊犲犮狋犻狅狀 采用超薄切片机将生物样品经固定包埋后 ， 切成厚度为 ６０ｎｍ ～ ８０ｎｍ 的超薄片 ， 用于透射电镜 观察 。 ３ 　 仪器设备和材料 ３ ． １ 　 主要仪器设备 ａ ） 　 透射电子显微镜 ； １ 犌犅 ／ 犜 ２１６３７ — ２００８ ｂ ） 　 超薄切片机 ； ｃ ） 　 修块机 ； ｄ ） 　 制刀机 （ 附玻璃刀条 ）； ｅ ） 　 钻石刀 ； ｆ ） 　 真空镀膜仪或溅射仪 ； ｇ ） 　 光学显微镜 ； ｈ ） 　 恒温烘箱 （ ３０℃ ～ ７０℃ ）。 ３ ． ２ 　 主要材料和试剂 ３ ． ２ ． １ 　 戊二醛 （ 犃犚 ） 戊二醛固定液 ， 配制方法见表 １ 。 表 １ 　 戊二醛固定液配制方法 戊二醛固定液最终浓度 ／ ％ ２．０ ２．５ ３．１ ２５％ 戊二醛 ／ ｍＬ １ １ １ ０．０７５ｍｏｌ ／ ＬＰＢＳ ／ ｍＬ １１．５ ９ ７ ３ ． ２ ． ２ 　 四氧化锇 四氧化锇固定液配制方法 ： Ａ 液 ： ２％ 锇酸储藏液 　　　 四氧化锇 　　 １ｇ 双蒸水 ５０ｍＬ Ｂ 液 ： １％ 锇酸固定液 　　　 Ａ 液 　　　　　　　 １ 份 ０．２４ｍｏｌ ／ ＬＰＢＳ１ 份 ３ ． ２ ． ３ 　 丙酮 （ 犃犚 ） ３ ． ２ ． ４ 　 环氧树脂 Ｅｐｏｎ８１２ 包埋配方表 ， 见表 ２ 。 表 ２ 　 犈狆狅狀 ８１２ 包埋配方表 配制数量配方比例 （ １∶９ ） 配方比例 （ ２∶８ ） ８１２ ＤＤＳＡ ＭＮＡ ａ ８１２ ＤＤＳＡ ＭＮＡ ａ 加速剂 ＤＭＰ３０ １ ０．５１ ０．０６ ０．４３ ０．５０ ０．１２ ０．３８ ０．０１５ ２ １．０３ ０．１２ ０．８５ １．００ ０．２５ ０．７５ ０．０３ ３ １．５４ ０．１８ １．２８ １．５０ ０．３７ １．１３ ０．０４５ ４ ２．０６ ０．２５ １．６９ ２．００ ０．５０ １．５０ ０．０６ ５ ２．５８ ０．３０ ２．１２ ２．５１ ０．６１ １．８８ ０．０７５ 　　 ａ 常用 ０．４％ 火棉胶  醋酸戊脂溶液或 ０．１％ ～ ０．２％ 聚乙烯醇缩甲醛膜 （ Ｆｏｒｍｖａｒ ） 氯仿溶液 。 ３ ． ２ ． ５ 　 醋酸铀 醋酸铀染色液配制方法 ： 使用棕色试剂瓶配制染液 ， 醋酸双氧铀 ２ｇ 加 ５０％ 乙醇 １００ｍＬ ， 充分搅拌 １０ｍｉｎ ， 静置 １ 天 ～ ２ 天后 ， 取其上清液或过滤后取其过滤液 。 醋酸铀染液在光照和高温下不稳定 ， 应 密封避光冷藏保存 。 ３ ． ２ ． ６ 　 柠檬酸铅 柠檬酸铅染色液配制方法 ， 见表 ３ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１６３７ — ２００８ 表 ３ 　 柠檬酸铅染色液配制方法 硝酸铅 Ｐｂ （ ＮＯ ３ ） ２ １．３３ ｇ 柠檬酸钠 Ｎａ （ Ｃ ６ Ｈ ５ Ｏ ２ ）· ２Ｈ ２ Ｏ １．７６ ｇ 双蒸水 ３０ｍＬ 　　 将上述成分放入 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 用力振荡 ３０ｍｉｎ ， 至溶液成乳白色混浊状后 ， 加入 １ＮＮａＯＨ８ｍＬ ， 使溶液变为清亮透明 ， 再加双蒸水至 ５０ｍＬ ， 染液 ｐＨ 值为 １２ ， 置 ４℃ 冰箱保存 。 ３ ． ２ ． ７ 　 磷钨酸 （ 犃犚 ） ２％ 磷钨酸水溶液 （ ＰＴＡ ）， ｐＨ 值为 ６．５ ～ ７．０ 。 ３ ． ２ ． ８ 　 磷酸盐 磷酸盐缓冲液配制方法 ： １ ） 　 ０．０７５ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液 （ ＰＢＳｐＨ 值为 ７．４ ）， 配制方法见表 ４ 。 表 ４ 　 磷酸盐缓冲液配制方法 ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ０．１９８ ｇ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ １．９３４ ｇ 双蒸水 １００ｍＬ 　　 ２ ） 　 ０．０７５ｍｏｌ ／ ＬＰＢＳ＋０．１９ｍｏｌ ／ Ｌ 蔗糖缓冲液 （ ｐＨ 值为 ７．４ ）， 配制方法见表 ５ 。 表 ５ 　 蔗糖缓冲液配制方法 ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ０．１９８ ｇ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ １．９３４ ｇ 蔗糖 ６．５０４ ｇ 双蒸水 １００ｍＬ 　　 ３ ） 　 ０．２４ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液 （ ＰＢＳｐＨ 值为 ７．４ ）， 配制方法见表 ６ 。 表 ６ 　 磷酸盐缓冲液配制方法 ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ０．７１２ ｇ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ６．９６２ ｇ 双蒸水 １００ｍＬ ４ 　 样品来源 ａ ） 　 分离病毒阳性或可疑阳性的培养细胞 ； ｂ ） 　 支气管肺泡冲洗液或咽喉含漱液中的脱落细胞 （ 含活细胞 ）； ｃ ） 　 病理活检和细针穿刺活检组织 ； ｄ ） 　 感染动物脏器的新鲜组织 ； ｅ ） 　 病毒感染细胞培养上清液 （ 低速离心除细胞残渣 ）； ｆ ） 　 提纯病毒悬液 （ 超速离心 １０００００ｇ ， ２ｈ ）。 ５ 　 样品制备 ５ ． １ 　 负染 ５ ． １ ． １ 　 负染原理 ： 负染是利用高密度重金属盐 （ 如磷钨酸 、 醋酸铀等 ） 染液 ， 将微小的病毒包围起来 ， 在 暗背景上显示病毒的微细结构 ， 呈现阴性反差 。 电镜图像片中病毒呈透明浅色和特有的外部亚微结构 ， ３ 犌犅 ／ 犜 ２１６３７ — ２００８ 背景则为无结构的灰色或黑色 。 负染样品不需要经过固定 、 脱水 、 包埋和超薄切片 ， 而是直接对含病毒 悬液进行染色 ， 操作简便 、 分辨率高 ， 可用于病毒快速诊断 。 ５ ． １ ． ２ 　 直接负染法 ５ ． １ ． ２ ． １