ICS65.020.30 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T25878—2010 对 虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV)检测 PCR法 Polymerasechainreaction(PCR)methodforinfectioushypodermaland haematopoieticnecrosisvirus(IHHNV) 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。 本标准主要起草人:黄倢、杨冰、朱泽闻、宋晓玲、孙喜模、赵红萍、刘莉。 ⅠGB/T25878—2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV)检测 PCR法 警告:使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验,本标准并未指出所有可能的安全问题。 使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)聚合酶链式反应(PCR)检测方法的 原理、所需试剂和材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。 本标准适用于对虾、环境生物、饵料生物和其他各种非生物样品中传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV)的定性检测。不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 SC/T7202.1—2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程 第1部分:压片显微镜检查法 SC/T7202.2—2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程 第2部分:PCR检测法 3 原理 3.1 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒及其流行特征 传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectioushypodermalandhaematopoieticnecrosisvirus, IHHNV)粒子大小为20nm~22nm,是无囊膜二十面体,在氯化铯中的浮力密度为1.40g/mL,含线 状单链DNA,长度为4.1kb,衣壳由4个分子质量分别为74kD、47kD、39kD、37.5kD的多肽组成。 IHHNV可感染世界各地的养殖对虾,其感染细角滨对虾(Litopenaeusstylirostris)会引起急性传 染病和高死亡率(90%),稚虾受到的危害最严重。IHHNV感染凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei) 会引起慢性“矮小残缺综合症”(RDS),主要影响是患病对虾生长缓慢,畸形,受感染存活对虾终生带毒, 通过垂直和水平传播。 3.2 技术原理 IHHNV的聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)是以IHHNV的一段389个碱基(b) 长度的特异性DNA序列作为模板,以与模板两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物,在四 种脱氧核糖核苷三磷酸存在下,利用依赖DNA的DNA聚合酶的合成作用,经过数十次变性、退火和延 伸的反应循环,使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性地级数扩增,再通过电泳等手段检 测到被特异性扩增的片段,从而揭示微量IHHNVDNA的存在。 4 试剂和材料 4.1 所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外,按照SC/T7202.2—2007中第5章的规定。 4.2 100ng/μL引物F:5′-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3′,-20℃保存。 4.3 100ng/μL引物R:5′-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3′,-20℃保存。 4.4 阳性对照为已知IHHNV阳性的组织样品的DNA模板,-20℃保存。 1GB/T25878—2010 4.5 阴性对照为已知IHHNV阴性的组织样品的DNA模板,-20℃保存。 4.6 空白对照以无菌双蒸水为模板。 5 仪器和设备 所需仪器设备按照SC/T7202.2—2007中第6章的规定。 6 操作步骤 6.1 反应体系的准备 6.1.1 PCR反应体系的准备应在洁净区完成。 6.1.2 PCR反应可选择25μL、50μL或100μL反应体系进行。 6.1.3 在PCR前区按表1的要求,加入除Taq酶以外的各项试剂,配制成无酶反应预混物。保存于 -20℃。在临用前,根据所需的反应份数,取出无酶反应预混物,加入相应体积的Taq酶,混匀,即成完 全的反应预混物。按1份/支分装到0.2mLPCR管中。如果PCR仪不具备热盖功能,再向各管内加 入50μL液体石蜡。暂存于4℃。 表1 100份PCR反应预混物所需试剂组成 试剂 25μL体系 50μL体系 100μL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液(无Mg2+) 250μL 500μL 1000μL 1× 氯化镁(25mmol/L) 200μL 400μL 800μL 2.0mmol/L dNTP(10mmol/L) 100μL 200μL 400μL 400μmol/L 100ng/μL引物F 75μL 150μL 300μL 3ng/μL 100ng/μL引物R 75μL 150μL 300μL 3ng/μL 灭菌双蒸水 1725μL 3450μL 6900μL — TaqDNA聚合酶(5U/μL) 25μL 50μL 100μL 0.05U/μL 100份反应总体积 2450μL 4900μL 9800μL 注1:25μL体系模板量0.5μL/反应管。 注2:50μL体系模板量1μL/反应管。 注3:100μL体系模板量2μL/反应管。 6.2 样品准备 6.2.1 样品的处理应在样品区完成。 6.2.2 样品采集的要求按SC/T7202.1—2007中附录B的规定执行。 6.2.3 活体或冰冻幼体、仔虾及体长在3cm以下稚虾个体样品约5mg~100mg(去掉稚虾眼)。活体 或冰冻的虾鳃、胃、游泳足或步足样品约5mg~100mg。活体或冰冻饵料生物样品约5mg~100mg。 池底表土样品约500mg。将上述待检样品放入灭菌1.5mL微型离心管中,应避免各样品间的交叉污 染。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗,然后浸于新配制的有效氯含量为3.0×10-3的含氯 消毒剂中5min,经无PCR产物污染的自来水充分清洗,再经蒸馏水淋洗后方可用于下一个样品。 6.3 DNA的提取 按照SC/T7202.2—2007中7.1.3的规定执行。 6.4 PCR扩增 6.4.1 在PCR前区,按照表1对各反应体系所需的模板体积要求,向各支含有1份反应预混物的PCR 管内加入相应体积的各样品DNA提取液,并设阳性对照、阴性对照和空白对照。 6.4.2 将上述加有样品模板的PCR管带入PCR后区,置于PCR仪中按以下程序进行扩增:95℃ 2GB/T25878—2010 5min;95℃30s、55℃30s、72℃1min,35个循环;72℃延伸7min,最后4℃保温。准备进行产物 的电泳。 6.5 PCR产物电泳 按照SC/T7202.2—2007中7.1.5~7.1.8的规定执行。 7 结果判定 7.1 阳性对照和阳性样品在389bp处应有一条特定条带出现;阴性对照和阴性样品在389bp处应无 条带出现,空白对照不出现任何条带。阳性对照在389bp处无特定条带出现或阴性对照在389bp处 有条带出现都表明PCR失败,应在排除故障和清除污染后,重新取样检测。对虾传染性皮下及造血组 织坏死病毒(IHHNV)PCR检测产物序列参见附录A。 7.2 条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少,但并不对应于模板的量的多少。 7.3 阳性结果表明被检样品中存在IHHNVDNA。对活虾和敏感宿主而言,提示已受IHHNV感染; 对冰鲜或冰冻对虾而言,提示曾受到IHHNV感染。 7.4 电泳结果的分析和问题排除方法参见附录B。 3GB/T25878—2010 附 录 A (资料性附录) 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)聚合酶链式反应(PCR)检测产物序列 1 GAGGAGAGAG CTGTAGTAGC GGAACACAAC CCGACTTTAT TGAAGGGACT CCCAACGGAC F 61 CGGACGAAAT GGACGGAAGG CGACTGGAAG AGAGTGAGAT TGATAAACAA GTGGAAAGTA 121 CAACATGGTA CACCTTCGTC ATCAGAGAAA AACCACAACC AAGAAGACTC TCCGGACGAA 181 CGCCAAACTT CACCATTACA GATCATGGTG ACCACTGGCA CATCACATAC TCCGGACACC 241 CAACCAATAA GACCAGACAT AGAGCTACAA TCCTCGCCTA TTTGGGAGTT ACCTTTGCTG 301 CCAGAGCCGA AGCTGAAGCG ACTACGGTAC TTGTTAGAAA TATCAAGAGA TGGATACTCT 361 ATCTTATCAG ATACGGTATT GAACGGCTTT CGTATTTTGG TCTTGGCCAC GCC