ICS65.020.30 B43 中华人民共和国国家标准 GB/T26612—2011 纯 血马DNA亲子鉴定技术规程 ProceduresofThoroughbredparentageverification withDNAtestingtechniques 2011-06-16发布 2011-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国农业大学马研究中心、中国马业协会。 本标准主要起草人:赵春江、吴常信、韩国才、张浩、吴克亮、杜丹、韩文朋。 ⅠGB/T26612—2011 纯血马DNA亲子鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了纯血马DNA亲子鉴定所用的方法、过程、结果的记录和解读等。 本标准适用于纯血马的亲子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GA/T383 法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T1119 进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法 PCR方法 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 纯血马 Thoroughbred 符合国际纯血马登记委员会(InternationalStudBookCommittee,ISBC)规定、在ISBC批准的成员 国登记委员会登记了的马匹。 3.2 微卫星DNA亲子鉴定方法 parentagetestingwithDNAtechnique 以微卫星DNA多态性及孟德尔遗传规律为基础的亲子鉴定方法。 4 原理 根据微卫星DNA的侧翼序列设计引物,对微卫星DNA位点进行扩增,其中包括国际动物遗传协 会(InternationalSocietyofAnimalGenetics,ISAG)和ISBC要求的九个微卫星位点。通过凝胶电泳判 定个体的基因型。根据孟德尔遗传规律,比对亲代个体和子代个体各微卫星DNA位点的基因型是否 相符,从而达到亲子鉴定的目的。 5 试剂与器材 5.1 试剂 5.1.1 乙醇(ethanol),分析纯。 5.1.2 异丙醇(isopropanol),分析纯。 5.1.3 氢氧化钠(NaOH),分析纯。 5.1.4 乙二胺四乙酸二钠(EDTA),分析纯。 5.1.5 氯化钠(NaCl),分析纯。 5.1.6 十二烷基硫酸钠(SDS),分析纯。 5.1.7 乙酸钾(CH3COOK),分析纯。 5.1.8 氯化锂(LiCl),分析纯。 1GB/T26612—2011 5.1.9 氯化钾(KCl),分析纯。 5.1.10 氯化镁(MgCl2),分析纯。 5.1.11 30%(质量分数)丙烯酰胺溶液:将29%丙烯酰胺和1%N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于去离子水, 充分搅拌溶解并过滤去杂质,避光保存。 5.1.12 过硫酸铵,分析纯。 5.1.13 硼酸(boricacid),分析纯。 5.1.14 乙酸,分析纯。 5.1.15 甘油,分析纯。 5.1.16 四硼酸钠,分析纯。 5.1.17 硝酸银(AgNO3),分析纯。 5.1.18 甲醛,分析纯。 5.1.19 溴化乙锭,分析纯。 5.1.20 TaqDNA聚合酶。 5.1.21 溴酚蓝,分析纯。 5.1.22 盐酸(HCl),分析纯。 5.1.23 三(羟基甲基)氨基甲烷(TrisBase),分析纯。 5.1.24 Tris-HCl:由TrisBase和HCl组成的缓冲溶液。 5.1.25 三磷酸脱氧核苷酸混合物(dNTPs):等量的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤 脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)的混 合物。 5.1.26 毛囊裂解液:200mmol/LNaOH。 5.1.27 中和液:200mmol/LHCl,100mmol/LTris-HCl,pH8.5。 5.1.28 缓冲液: a) 血液裂解缓冲液(BufferA):100mmol/LTris-HCl(pH7.5),100mmol/LEDTA,100mmol/L NaCl,0.5%(质量分数)SDS; b) 蛋白沉淀缓冲液(BufferB):200mL5mol/LCH3COOK,500mL6mol/LLiCl混匀后使用; c) DNA溶解缓冲液(TE):10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH=8.0; d) 电泳解缓冲液5×TBE:446mmol/LTrisBase,445mmol/LBoricAcid,10mmol/LEDTA (pH8.0); e) 电泳解缓冲液50×TAE:2mol/LTris碱,1mol/L冰乙酸,0.1mol/LEDTA(pH8.0); f) 上样缓冲液:30mmol/LEDTA,36%(体积分数)丙三醇,0.05%(质量/体积分数)溴酚蓝, pH=7.0; g) 10×PCR缓冲液:100mmol/LTris-HCl(pH8.0),0.5mol/LKCl,15mmol/LMgCl2。 5.1.29 琼脂糖(分析纯)。 5.1.30 N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)。 5.1.31 琼酯糖胶:琼脂糖加入电泳解缓冲液,加热熔解冷却后制成的胶状物,可用于DNA电泳。 5.2 器材 5.2.1 全自动DNA分析仪。 5.2.2 离心机,离心力10000g。 5.2.3 紫外可见分光光度计。 5.2.4 移液器,量程0.1μL~1000μL。 5.2.5 PCR仪,96孔热循环。 5.2.6 水平电泳槽,长度31cm。 2GB/T26612—2011 5.2.7 垂直电泳槽,长度24cm。 5.2.8 凝胶成像系统。 5.2.9 漩涡振荡仪。 5.2.10 剪刀。 6 DNA亲子鉴定规程 6.1 DNA的提取 采取血液或带有毛囊的马毛发,从中提取DNA。具体方法参见附录A。DNA样品操作注意事项 见SN/T1119。 6.2 亲子鉴定所用DNA微卫星位点 亲子鉴定所用DNA微卫星位点应包括ISAG和ISBC要求的如下九个微卫星位点:AHT4, AHT5,ASB2,HMS3,HMS6,HMS7,HTG4,HTG10,VHL20。在所扩增的位点中还可包括 HTG6,HTG7,HMS2等三个微卫星位点或其他若干个已被证实在纯血马群体中多态性丰富的微卫星 位点,以进一步提高亲子鉴定的准确性。引物序列参见附录B。 6.3 DNA微卫星位点的扩增 可用荧光物质标记用于扩增上述12个位点的引物,采用PCR方法扩增这些微卫星位点。PCR条 件参见附录C。PCR操作中防止污染等注意事项见GA/T383。 6.4 基因型的检测 使用根据荧光信号探测PCR产物大小的全自动DNA分析仪或聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染(参见 附录D)等可检测两个碱基长度差异的方法检测上述12个位点的基因型。在分析中设置对照样本。上 述操作技术要求见SN/T1193。 6.5 基因型的表示方法 基因型用国际通用的字母表示。在所检测的微卫星位点中,等位基因数为奇数的,片段长度居中的 基因型记为“M”;如等位基因数为偶数,居中的两个基因型中片段较小的定义为“M”。其他等位基因对 照“M”按升序排列。微卫星位点基因型的记录参见附录E。 6.6 亲子关系的判断 根据两亲本及子代个体的基因型判断其是否存在亲子关系。基因型的读取和亲子关系的判断由两 人分别独立完成,其结果互相印证。 6.7 否定个案的重复检测 对于亲本和子代个体的基因型不符的个案,重新采取DNA样品进行鉴定,两次鉴定结果一致方能 确定为不存在亲子关系。 7 亲子鉴定结果的记录 7.1 亲、子代基因型相符的个案鉴定结果的记录 对于亲本和子代个体的基因型相符的个案,记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基 因型,并记录“根据上述微卫星位点的基因型检测,不能排除子代个体与两亲本存在亲子关系”,并由亲 子鉴定负责人签字。 7.2 亲、子代基因型不相符的个案鉴定结果的记录 对于亲本和子代个体的基因型不符的个案,记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基 因型,并记录“根据上述微卫星位点的基因型检测,可排除子代个体与两亲本存在亲子关系”,并由亲子 鉴定负责人签字。 3GB/T26612—2011 附 录 A (资料性附录) 从血液或毛囊中提取DNA A.1 马血液样品DNA的提取 A.1.1 从马颈静脉采取血样5mL,用移液器量取100μL10%(质量分数)EDTA抗凝。 A.1.2 取50μL血液样品放入1.5mL离心管中。 A.1.3 加入400μLBufferA,充分混合至凝块消失。 A.1.4 65℃温浴2h~4h。 A.1.5 加入800μLBufferB,颠倒混合,然后冰浴10min(或放入-20℃冰箱内5min~10min)。 A.1.6 用离心机在室温下以12000r/min离心15min。 A.1.7 吸取1mL上清液于另一新的1.5mL离心管中。注意不要吸到下层沉淀物或表层漂浮物,必 要时可重复离心去除沉淀物。 A.1.8 加入600μL异丙醇(isopropanol),颠倒混合几次。 A.1.9 室温12000r/