ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27527—2011 禽 脑脊髓炎诊断技术 Diagnostictechniquesforavianencephalomyelitis 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:内蒙古农业大学、内蒙古动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、北 京世纪元亨动物防疫技术有限公司、扬州大学、青岛易邦生物工程有限公司。 本标准主要起草人:赵振华、赵心力、陈西钊、孙明、王金玲、秦爱建、范根成、李瑞刚、乌日罕。 ⅠGB/T27527—2011 禽脑脊髓炎诊断技术 1 范围 本标准规定了禽脑脊髓炎诊断技术,包括流行病学、临床症状、组织病理学变化、病毒分离、琼脂免 疫扩散试验、中和试验和间接免疫荧光试验。 本标准适用于禽脑脊髓炎的诊断、检疫和流行病学调查。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AE(V):禽脑脊髓炎(病毒)[avianencephalomyelitis(virus)] AEV-VR:禽脑脊髓炎病毒VanRoekel株(AEV标准株)(avianencephalomyelitisvirus-Van Roekel) EID50:鸡胚半数感染量(egginfectiousdose) FITC:异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate) H.E.染色:苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline) 3 流行病学 除鸡易感AEV外,雉鸡、鹌鹑、火鸡和山鸡也可自然感染。无本病史和未经免疫的鸡群一旦感染, 雏鸡发病率通常为40%~60%、死亡率为10%~80%或更高。不同日龄的鸡一年四季均可感染。随日 龄的增长,鸡对AEV的抵抗力不断增强。感染鸡的种蛋可以引起后代鸡胚和雏鸡发病(垂直传播);同 时,病鸡的分泌物和排泄物可污染环境、饲料和饮水,引起与其接触的易感鸡发病(水平传播)。自然情 况下4周龄以内的雏鸡(幼禽)对AEV最易感;实验室情况下,1日龄雏鸡脑内接种AEV强毒5d~7d 后可发病;经胚胎感染的雏鸡出壳后潜伏期1d~7d,口服感染或自然接触一般9d~11d后发病。 4 临床症状 自然感染和人工感染雏鸡的临床症状基本一致,初期精神沉郁、嗜睡、易惊、斜视、呈半蹲姿势、头颈 偏向一侧、饮水困难,双腿紧缩、叉开或爪蜷缩,以后可出现站立不稳、进行性运动失调、头颈快速震颤等 症状,甚者常因瘫痪、衰竭而死亡。成年鸡感染后一般不出现明显症状,有时仅见轻微腹泻,产蛋率下降 10%~40%和种蛋孵化率降低。 5 组织病理学变化 5.1 材料准备 5.1.1 器材 石蜡切片机、染色缸、载玻片、盖玻片、水浴锅、温箱、显微镜等。 1GB/T27527—2011 5.1.2 试剂 10%中性福尔马林溶液、酒精、二甲苯、切片石蜡、H.E.染色液、中性树胶等。 5.1.3 样品 临床可疑AE病例的大脑、中脑、小脑、延脑和腰荐部脊髓样品。 5.2 操作方法 分别切取小块(0.5cm3~1cm3)大脑、中脑、小脑、延脑和腰荐部脊髓样品置10%中性福尔马林溶 液中固定24h~48h。常规制片、H.E.染色、中性树胶封片、光镜观察。 5.3 病理变化 5.3.1 中枢神经系统典型的组织病理学变化为非化脓性脑脊髓炎,主要包括大脑、中脑、小脑、延脑和 脊髓的变质性变化、血管反应和胶质细胞增生。 5.3.2 变质性变化表现为神经细胞变性和神经组织出现小软化灶。变性的神经细胞肿大、淡染或浓 缩,有的呈现中央染色质溶解现象。变性严重的神经细胞和局部神经组织可发生坏死、液化,形成小软 化灶。 5.3.3 血管反应表现为血管出现以淋巴细胞为主的围管性细胞浸润,浸润的细胞在血管周围散在或呈 多层围绕,形成管套。 5.3.4 胶质细胞增生表现为增生的胶质细胞可出现在变性神经细胞周围形成卫星现象,或进入坏死的 神经细胞中吞噬坏死物形成噬神经原现象。在软化灶处有数量不等的胶质细胞增生和聚集形成胶质 小结。 5.4 结果判定 若5.3.2~5.3.4同时出现时则为非化脓性脑脊髓炎的典型病变,若主要出现5.3.3,而5.3.2不 明显时,可能与免疫反应有关,常见于免疫鸡群。 通过流行病学、临床症状和组织病理学变化可对AE做出初步诊断,在初步诊断的基础上,进行病 毒分离(见第6章)。 6 病毒分离 6.1 材料准备 6.1.1 器材 无菌剪刀、镊子、平皿、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器,孵化器、离心机、高压灭菌器、冰柜、生物 安全柜等。 6.1.2 试剂 生理盐水、青霉素、链霉素。 6.1.3 材料 SPF种蛋、SPF雏鸡。 2GB/T27527—2011 6.1.4 病料 (可疑)AE病雏脑组织(以发病早期为好)。 6.2 操作方法 6.2.1 病料的采集与保存 无菌取病雏鸡脑组织后应立即处理(见6.2.2),若暂时不能处理,可于-70℃冰柜中保存。 6.2.2 病料处理 将病料无菌称量、研磨,反复冻融3次,用无菌生理盐水溶液作1∶5稀释制成悬液,并加双抗(双抗 终浓度为1000IU/mL青霉素,100μg/mL链霉素)。样品经4000r/min离心10min,取上清液即为 自然病雏脑组织病毒液,冻存、备用。 6.2.3 雏鸡接种 取6.2.2处理好的病毒液,以0.05mL/羽脑内接种1日龄SPF雏鸡,待出现AE症状后采血致死, 同上述方法取脑研磨、制备,获得接种病雏脑组织病毒液,冻存、备用。 6.2.4 鸡胚接种 取6.2.3病毒样本,以0.2mL/胚,经卵黄囊无菌接种6日龄SPF鸡胚,每份样本至少接种5枚 胚,于37℃孵化箱内孵育至16日龄收毒、观察鸡胚病变(同时设未接种病料的健康对照组)。收毒时, 首先无菌吸取胚液(尿囊液和羊水),然后观察胚体发育情况;检查胚体、胚脑病变;取胚脑、胃、肠、胰腺 称量、研磨、以胚液作1∶5稀释,同6.2.2加入双抗、离心,制成鸡胚组织病毒液,即为AE自然发病雏 鸡第1代胚病毒液(AEVE1)。取AEVE1按照本条上述方法再接种6日龄SPF鸡胚卵黄囊、孵化、收 毒、检查鸡胚病变、制备第2代胚病毒液(AEVE2)。这样连续传代直至传代鸡胚出现病变时,该代鸡胚 病毒液即可作为病毒鉴定用的AE分离毒病毒液。同时可进行病毒某些特性的检测。 与健康对照组鸡胚相比,发病鸡胚病变为:胚体活力减弱、发育不良和肌肉萎缩(胚体重减轻)、腿细 爪曲或强直,脑萎缩,皮下、脑、胃肠水肿、出血等。病毒分离后,可通过琼脂免疫扩散试验、中和试验和 间接免疫荧光试验中的任一种方法进行病毒鉴定(见第7章)。 7 AE的确诊和病毒鉴定 7.1 琼脂免疫扩散试验 7.1.1 器材准备 7.1.1.1 器材 冰箱、天平、90mm直径的平皿、微量加样器、塑料吸头和打孔器(内径4.0mm、孔间距3.0mm的 7孔梅花样金属打孔器)。 7.1.1.2 试剂 禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验冻干抗原(1mL/安瓶)、标准阳性血清和阴性血清、氯化钠、优质琼 脂粉、pH7.20.01mol/LPBS(或生理盐水)、蒸馏水和1%硫柳汞溶液(见附录A)。 7.1.1.3 待检血清 无菌翅下静脉采血1mL左右,分离血清,-20℃冰箱保存备用。 3GB/T27527—2011 7.1.1.4 待检抗原 6.2.4AE分离毒抗原和其他待检抗原。 7.1.2 操作步骤 7.1.2.1 琼脂板制备 琼脂板的制备按如下步骤进行: a) 琼脂液配制:称取优质琼脂粉1.0g,加蒸馏水至100mL。加热溶化后,加入氯化钠18g,充分 溶解后,加入1%硫柳汞溶液(终浓度为0.01%),摇匀。 b) 制板:将琼脂液冷却至47℃~70℃,取洁净、干燥、直径为90mm的灭菌平皿,放置于无菌工 作台内,每个平皿加琼脂液18mL,厚度约为3.0mm。凝固后盖严,把平皿倒置放入4℃冰 箱中保存备用(保存期2周)。 7.1.2.2 打孔 从冰箱内取出琼脂板,用7孔一组的梅花形打孔器打孔(中间1孔,外周6孔,见图1),孔径 4.0mm,孔距3.0mm。将孔中的琼脂轻轻挑出或吸出,勿伤及孔边缘或使琼脂层脱离平皿底。 图1 平皿中梅花形7孔一组排列示意图 7.1.2.3 封底 在酒精灯火焰上通过4次~6次加热平皿底面,使底部琼脂稍微融化即可。 7.1.2.4 抗原稀释 向1安瓶抗原内加入PBS(或生理盐水)1mL,待溶解呈均匀混悬液时即为可使用的AE琼扩抗 原液。 7.1.2.5 加样 根据需要和具体条件,可分别应用血清样品或抗原样品按以下处理方式进行加样: a) 检验血清加样:结合图2,用微量加样器吸取抗原液加入中央孔,标“+”的三孔加标准阳性血 清,1、2、3孔加被检血清,每孔均应加满,但不能溢出。每加一个被检样品应换一个吸头。 图2 加样示意图 4GB/T27527—2011 b) 检验抗原加样:结合图2,用微量加样器吸取标准抗体溶液(AE标准阳性血清)加入中央孔,标 “+”的三孔加标准抗原液,1、2、3孔加待检抗原液,每孔均应加满,但不能溢出。每加一个被 检样品应换一个吸头。 7.1.2.6 反应 加样完毕,室温静置10min,放入22℃~26℃保湿盒内反应,分别在24h、48h和72h观察并记 录结果。 7.1.3 结果判定