ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27533—2011 犬 细小病毒病诊断技术 Diagnostictechniquesforcanineparvovirusdisease 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:单虎、温建新、熊炜、黄娟、秦晓冰、于鹏程。 ⅠGB/T27533—2011 犬细小病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR检测的操作方法。 本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑 制试验、PCR检测适用于犬细小病毒病的病原诊断。 2 试剂和材料 2.1 FK81细胞(猫肾细胞)。 2.2 0.9%生理盐水:配制参见附录A中A.1。 2.3 1%猪红细胞液:配制参见附录A中A.2。 2.4 犬细小病毒阳性血清。 2.5 96孔“v”形微量反应板。 2.6 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液:Taq酶浓度为5U/μL,-20℃保存。 2.7 1.5mLEppendorf管。 2.8 0.2mLPCR薄壁管。 2.9 dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L,-20℃保存。 2.10 引物:浓度为20μmol/L,其序列如下: 上游引物(CPVF):5′GAATCTGCTACTCAGCCACCAAC3′; 下游引物(CPVR):5′GTGCACTATAACCAACCTCAGC3′。 2.11 10%十二烷基硫酸钠:配制参见附录A。 2.12 蛋白酶K贮备液:配制参见附录A中A.4。 2.13 5×TBE电泳缓冲液:配制参见附录A中A.6。 3 器材和设备 3.1 PCR仪。 3.2 高速台式冷冻离心机:可控温至4℃、离心速度可达12000g以上。 3.3 水平电泳仪。 3.4 凝胶成像系统。 4 临床检查 4.1 临床特征 4.1.1 潜伏期1周到2周,病初无任何症状,食欲减退或废绝,体温40℃以上,粉红色黏稠血样物。 4.1.2 病犬先出现呕吐,呕吐出白色泡沫或黄色液体,继而腹泻,粪便稀薄而恶臭,剧烈的腹泻呈喷射 状,粪便呈红色,混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁样稀便,并有特殊的腥臭味。 4.1.3 患犬迅速消瘦,倦卧不起,目光呆滞,眼窝下陷,腹围紧缩,机体脱水,皮肤干燥、弹性降低。 4.2 病理变化 4.2.1 心脏肿大呈灰黄色,切面外翻,质地松软,心肌有出血性斑纹。 4.2.2 肝脏肿大,包膜紧张,多呈黄褐色,质地松软有局灶性坏死,断面有豆蔻状花纹。 4.2.3 胃空虚,黏膜轻度潮红,附有大量黏液;小肠壁增厚,肠管变粗,肠腔狭窄,形成厚层黏膜皱褶,易 1GB/T27533—2011 于剥落,肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。 4.3 判定 若临床症状符合4.1.1或4.1.2且出现4.2.1或4.2.3的病理变化,则可判定疑似犬细小病毒病, 其他临床症状和病理变化可作为参考指标;疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行 确诊。 5 血凝与血凝抑制试验 5.1 血凝试验(HA)的操作方法 5.1.1 样品采集活犬的泪液、鼻液、唾液、粪便,病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样 品加等体积生理盐水研磨匀浆,3000g离心15min,收集上清液待检;口腔拭子、粪拭子用少量生理盐 水浸润后,取上清液待检。 5.1.2 在96孔“v”形微量反应板上进行,自左至右各孔加100μL生理盐水。 5.1.3 于左侧第1孔加50μL待检样品于1.5mLEppendorf管,混合均匀后,吸50μL至第2孔,混 合均匀后,吸50μL至第3孔,依次倍比稀释,至第11孔,吸弃50μL,稀释后病毒稀释度为第1孔 1∶2,第2孔1∶4,第3孔1∶8……最后12孔为对照。 5.1.4 由左至右依次向各孔加1%猪红细胞悬液50μL置微型混合器上振荡,使血球与病毒充分混 合,在37℃温箱中作用15min~30min后,待对照红细胞已沉淀可观察结果。 5.1.5 判定结果:以100%凝集(血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底)的病毒最大稀释孔为该病毒血凝 价,即一个凝集单位,不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。 5.2 血凝抑制试验(HI)的操作方法 5.2.1 根据HA试验结果,确定病毒的血凝价,配成4个血凝单位病毒溶液。 5.2.2 在96孔“v”形微量板上进行,用固定病毒稀释血清法,自第1孔至第10孔各加50μL生理盐 水,11和12孔分别为4单位CPV细胞病毒培养液和抗犬细小病毒阳性血清对照。 5.2.3 第1孔加犬细小病毒阳性血清50μL,混合均匀,吸50μL至第1孔,依此倍比稀释至第10孔, 吸弃50μL,如此稀释后血清浓度为第1孔1∶2,第2孔1∶4,第3孔1∶8…… 5.2.4 由第1孔至11孔各加50μL,4单位待测病毒液,第12孔50μL血清,混合均匀,置37℃温箱 再作用15min~30min,待4单位病毒已凝集红细胞可观察结果。 5.2.5 判定结果:被已知犬细小病毒阳性血清抑制血凝者,该病毒为犬细小病毒。 6 PCR检测 6.1 病料的采集及处理 采集的样品包括犬的泪液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便 样品加等体积生理盐水研磨匀浆,3000g离心15min,收集上清液待检。口腔拭子、粪拭子用少量生理 盐水浸润后,取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品,收集细胞沉淀待检。CPV阳性对照样品和 阴性对照样品的同样处理。 6.2 DNA抽提 取上清液465μL,加入25μL10%十二烷基硫酸钠和10μL的20mg/mL蛋白酶K,50℃水浴摇 床上放置2h;加入等量的饱和酚溶液500μL,振荡混匀20s,12000g离心5min,取上清液;加入等量 的酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1),振荡混匀20s,12000g离心5min,取上清液;再加入等量的三 氯甲烷∶异戊醇(24∶1),振荡混匀20s,12000g离心5min,取上清液;最后加入两倍体积的无水乙 醇,上下颠倒混匀,12000g离心10min,弃上清,室温干燥后,加入50μL双蒸水溶解沉淀,即得DNA 模板,-20℃贮存备用。CPV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行样品处理,并进行 DNA抽提。另外,DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。 2GB/T27533—2011 6.3 PCR检测 在0.2mLPCR薄壁管中,按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP0.5μL、Taq酶 0.5μL、DNA模板2μL、上游引物和下游引物(CPVF、CPVR)各0.5μL、三蒸水18.5μL,配制PCR检 测体系。将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增:首先94℃变性2min;再94℃、30s,55℃、30s, 72℃、40s进行35个循环;最后72℃、3min。用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板(含 0.5μg/mLEB),参见附录A中A.7,将平板放入水平电泳仪,使电泳缓冲液刚好没过胶面,将10μL PCR产物和2μL加样缓冲液(6×),参见附录A中A.8,混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标 准分子量作对照。5V/cm电泳约30min,当溴酚蓝到达底部时停止,用凝胶成像系统观察结果。 6.4 结果判定 6.4.1 经PCR检测,CPV阳性对照样品可扩增出大小为609bp的核酸片段,参见附录B,且阴性对照 样品无扩增条带,否则试验结果视为无效。 6.4.2 在符合6.4.1的条件下,若待检样品扩增出了大小为609bp的核酸片段,则初步判定犬细小病 毒核酸阳性;若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为609bp,则判定犬细小病毒核酸阴性。 6.4.3 待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定,若其序列与提供的比对序列的同源性大 于等于90%,则可确诊为犬细小病毒核酸阳性,否则判定犬细小病毒核酸阴性。 6.4.4 若犬细小病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性,则可判定犬细小病毒感染阳性。 3GB/T27533—2011 附 录 A (资料性附录) 试剂及其配制 A.1 0.9%生理盐水 称取9g无水氯化钠溶于1000mL去离子水中配成0.9%生理盐水,121.3℃灭菌15min。 A.2 1%猪红细胞液 1mL新鲜肝素抗凝猪血加入9mL灭菌生理盐水制备而成。制备好后最好立即使用。暂时不用 可放置4℃冰箱保存。 A.3 CPV细胞培养液 CPV接种FK81细胞,培养3d~5d,当病变达60%~80%时收获。冻融三次或超声波处理后,低 速离心去除细胞碎片,上清液分装后低温保存。 A.4 10%十二烷基硫酸钠(SDS) 在90mL三蒸水中溶解10g十二烷基硫酸钠(电泳级),加热至60℃助溶,用盐酸调pH值至7.8, 加三蒸水定容至100mL。 A.5 蛋白酶K贮备液(20mg/mL) 每升三蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.21mg,乙二胺四乙酸(EDTA)1.86mg,十二烷基硫 酸钠(SDS)5g,用盐酸调pH值至7.8。取该溶液按每毫升加入20mg蛋白酶K,充分溶解后分装。 A.6 5×TBE电泳缓冲液 每升三蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷(Tr