ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27537—2011 动 物流感检测 A型流感病毒分型基因 芯片检测操作规程 Animalinfluenzadetection—ProtocolofDNAmicroarrayexamination forinfluenzaAvirussubtypes 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中国人民解放军军事医学科学院、中国兽医药品监 察所。 本标准主要起草人:韩雪清、刘伯华、李建、林祥梅、王慧煜、刘建、陈茹、侯义宏、刘业兵、贾广乐、 吴绍强、梁成珠、秦智锋、宁宜宝、薄清如、王伊琴。 ⅠGB/T27537—2011 动物流感检测 A型流感病毒分型基因 芯片检测操作规程 1 范围 本标准规定了A型流感病毒分型基因芯片检测的操作规程。 本标准适用于口岸样品中A型流感病毒全部亚型(H1~H16,N1~N9)的筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ctr1、ctr2和ctr3:质控探针1、2和3(control1、control2andcontrol3) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) PBS:磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersolution) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RT-PCR:反转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction) SDS:十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate) SSC:氯化钠/柠檬酸钠缓冲液(sodiumchloride-sodiumcitratebuffer) TAMRA:羧基四甲基若丹明(carboxytetramethylrhodamine) 4 主要试剂和仪器 4.1 主要试剂 4.1.1 试验用水 蒸馏水,按照GB/T6682,三级用水,除另有规定外,所用生化试剂均为分析纯。 4.1.2 提取试剂 Trizol试剂等或商品化的病毒RNA提取试剂。 4.1.3 A型流感病毒多重不对称RT-PCR扩增引物和探针的合成 特异性引物和探针(参见附录A)。探针和引物合成后,采用无RNA酶的水(参见附录B)分别溶解 为50μmol,-20℃保存备用。 1GB/T27537—2011 4.1.4 RT-PCR反应试剂 一步法RT-PCR缓冲液,dNTP,酶混合物,RNA酶抑制剂等。 4.1.5 基因芯片 含有A型流感病毒16个HA亚型和9个NA亚型特异性探针和质控探针,参见附录C。 4.1.6 基因芯片杂交液 商品化的基因芯片杂交液(参见附录B),每份含有ddH2O0.7μL,20×SSC1.5μL, 50×Denhardt’s1.5μL,50%(质量体积比)硫酸葡聚糖3.0μL,4%(质量体积比)SDS1.5μL,共 8.2μL/份。 4.1.7 杂交质控探针 TAMRA荧光标记的一段寡核苷酸(ctr1),与芯片上杂交阳性参照(PC,ctr2)序列互补,用于质控 杂交过程(序列参见附录A)。合成后,采用无RNA酶的水溶解为50μmol/L,-20℃保存备用。 4.2 仪器 4.2.1 微型台式高速冷冻离心机(大于13000r/min)。 4.2.2 PCR仪。 4.2.3 涡旋混匀器。 4.2.4 恒温水浴箱。 4.2.5 芯片杂交盒。 4.2.6 脱色摇床。 4.2.7 基因芯片扫描仪。 4.2.8 冰箱(2℃~8℃、-20℃和-80℃三种)。 4.2.9 微量可调移液器。 4.2.10 离心管和枪头。 5 操作方法 5.1 采样工具 下列采样工具应经(121±2)℃,15min高压灭菌并烘干: ———棉拭子; ———剪刀; ———镊子; ———1.5mL离心管; ———研钵。 5.2 样品采集 5.2.1 活动物 取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下: ———取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次~3次并旋转,取鼻腔分泌液; ———取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮2次~3次并旋转,取咽喉分泌液; 2GB/T27537—2011 ———取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便; ———将采样后的拭子分别放入盛有1.0mLPBS的1.5mL离心管中,加盖、编号。 5.2.2 脏器或肌肉组织 用无菌镊子和剪刀等工具采集待检脏器或肌肉组织,装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号。 5.3 样品贮运 样品采集后,放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋),于保温箱中加冰、密封,24h 内送实验室。 5.4 样品的处理 5.4.1 棉拭子处理方法 样品在混匀器上充分混合后,用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出,室温放置30min,取上清液转 入无菌的1.5mL离心管中,编号备用。 5.4.2 肌肉或组织脏器处理方法 取待检样品2.0g,加入等量灭菌石英砂,于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加入10mLPBS 混匀,4℃,3000r/min离心15min,取上清液转入无菌的1.5mL离心管中,编号备用。 5.5 样品RNA的制备 5.5.1 取上清液200μL,分别加入1.5mL离心管内,各加入Trizol试剂1.0mL,反复混匀,冰上放置 5min。 5.5.2 加入200μL氯仿,小心盖上帽盖,用力摇动离心管15s,室温放置5min。 5.5.3 12000r/min,4℃,离心15min,可见分为三层,上层水相含RNA。 5.5.4 转移水相至一新离心管内,加入等量异丙醇,混匀,室温放置15min。 5.5.5 12000r/min,4℃,离心10min,离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉淀(对于细胞毒 而言,可能看不到沉淀)。 5.5.6 小心吸弃上清,加入500μL75%乙醇(用DEPC水配制),小心颠倒以漂洗沉淀及管壁, 12000r/min,4℃,离心5min。 5.5.7 小心吸弃上清,室温干燥RNA沉淀5min~10min。然后加入20μL无RNA酶的水溶解沉 淀。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增,若需长期保存,应放置-80℃冰箱保存。 5.6 A型流感病毒RNA多重不对称RT-PCR扩增体系 5.6.1 引物混合比例 25对引物分为4组。第1组包括H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2,其中H5和H7亚型的上游 引物为0.65μL,下游引物为1.3μL,N2亚型的上游引物为0.6μL,下游引物为1.2μL,其余亚型的上 游引物均为0.5μL,下游引物均为1μL;第2组包括H2、H4、H8、H10、H11、H13、H15和H16,每个亚 型的上游引物均为0.5μL,下游引物均为1μL;第3组包括H14、N4、N6、N7和N9,其中N7上游引物 为0.65μL,下游引物为1.3μL,其余亚型上游引物均为0.5μL,下游引物均为1μL;第4组包括H12、 N3、N5和N8,其中N5上游引物为0.6μL,下游引物为1.2μL,其余亚型上游引物均为0.5μL,下游 引物均为1μL。 5.6.2 RT-PCR反应体系 每个样品分4个管进行RT-PCR。在0.2mLPCR反应管中依次加入一步法RT-PCR缓冲液 3GB/T27537—2011 10μL,10mmol/LdNTP2.0μL,酶混合物2.0μL,RNA酶抑制剂0.5μL,通用引物上游0.5μL、下 游5.0μL,RNA模板5.0μL,按照4组引物混合物的用量分别加入引物混合物,补无RNA酶的水至 50.0μL。置于PCR仪立即进行RT-PCR扩增。 5.7 A型流感病毒多重不对称RT-PCR反应条件 反应条件:50℃30min;95℃15min;94℃20s,52℃60s,72℃90s,共20个循环;然后94℃ 20s,70℃90s,共20个循环;最后72℃延伸10min。扩增反应结束后,取出放置于4℃。 5.8 基因芯片的杂交、洗涤与扫描 5.8.1 杂交步骤 5.8.1.1 扩增产物5.2μL(4组RT-PCR产物各取1.3μL)﹑杂交质控探针0.8μL和杂交液6μL于 0.2mLPCR管中,混匀。 5.8.1.2 95℃变性5min,立即冰浴3min,4000r/min离心5s~10s,将离心管放回冰浴。 5.8.1.3 在杂交盒的沟槽中加入200μL蒸馏水以防止杂交体系蒸发,将芯片正面向上放入盒中。 5.8.1.4 将已变性的杂交样品从冰盒中取出,用枪头轻轻吹吸3次~5次。 5.8.1.5 取7μL杂交混合液加到探针点阵区,迅速盖上盖片和杂交盒并密封。 5.8.1.6 将杂交盒水平放入52℃的水浴锅中,杂交2.5h。 5.8.2 洗涤步骤 5.8.2.1 杂交结束后,立即将芯片取出,放入预热至45℃的洗涤液Ⅰ中,100r/min水平振荡洗涤 5min,相同条件重复一次。 5.8.2.2 取出芯片,放