ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27644—2011 禽 疱疹病毒2型荧光PCR检测方法 Protocolofreal-timePCRfordetectingGallidHepersVirus2 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、扬州大学、河南农业大学。 本标准主要起草人:詹爱军、刘文博、王新卫、卢体康、花群义、陈书琨、秦智锋、陈兵、高小博。 ⅠGB/T27644—2011 禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了禽疱疹病毒2型荧光PCR检测的操作方法。 本标准适用于禽疱疹病毒2型的鉴定及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 DNA:deoxyribonucleicacid 脱氧核糖核酸。 dNTP:deoxy-ribonucleosidetriphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷。含有dCTP、dGTP、dATP、 dTTP四种脱氧核糖核苷。 EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid 乙二胺四乙酸。 GHV2:GallidHepersVirus2 禽疱疹病毒2型(马立克氏病病毒血清1型)。 MD:Marek’sDisease 马立克氏病。 PBS:phosphatebelancedsolution 磷酸盐缓冲生理盐水。 PCR:polymerasechainreaction 聚合酶链式反应。 Real-timePCR:Real-timepolymerasechainreaction 实时荧光聚合酶链反应。 Taq酶:Thermusaquaticuspolymerase 耐热DNA聚合酶。 4 试剂 4.1 试剂级别:除另有规定,本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水,所用化学试剂均为分 析纯。 4.2 禽疱疹病毒2型荧光PCR检测试剂盒,-20℃保存,组成及使用注意事项参见附录A。 4.3 引物和探针序列(产物长度142bp) 上游引物:5’CCACCACCTCCCATCTGTAC3’ 下游引物:5’GACAAGGCTGAGCGTAAACC3’ TaqMan探针:5’ACACGGCTCGGTAACAGGACACAATG3’,其5’端和3’端分别标记FAM 和BHQ(或Tamra或Eclipse)。 4.4 1%肝素钠,配制方法见B.1,4℃保存。 4.5 三氯甲烷,常温保存。 1GB/T27644—2011 4.6 异丙醇,使用前预冷至-20℃。 4.7 无水乙醇。 4.8 75%乙醇,采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制,使用前预冷至-20℃。 4.9 0.01mol/LPBS,pH7.2,配制方法见B.2。 5 器材和设备 5.1 无菌注射器,1mL,5mL,10mL,25mL,100mL。 5.2 一次性无菌塑料袋。 5.3 1.5mL无DNA酶和RNA酶的Eppendorf管。 5.4 0.2mL无DNA酶和RNA酶的PCR薄壁管、八联管或96孔板。 5.5 荧光PCR检测仪。 5.6 高速台式冷冻离心机,可控温至4℃、离心速度可达12000g以上。 5.7 振荡器。 5.8 研钵。 5.9 普通冰箱和超低温冰箱:规格2℃~8℃,-20℃,-80℃。 5.10 微量移液器,0μL~2μL,1μL~10μL,10μL~100μL,20μL~200μL,100μL~1000μL,并配 备与移液器匹配的无DNA酶和RNA酶的吸头。 6 样品的采集和处理 6.1 样品的采集 6.1.1 全血 用预先加入1%肝素钠的无菌注射器直接吸取全血至无菌Eppendorf管中,盖上管盖并编号。 6.1.2 羽毛和组织脏器 取待检羽毛(从根部挤出少量羽髓)、肝脏、肾脏和脾脏样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,编 号,送实验室。 6.2 样品贮运 样品采集后,放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品,放一个塑料袋),于保温箱中加冰、密封,送 实验室。 6.3 样品处理 6.3.1 全血 3000g离心30min,取棕黄色层转入无菌的1.5mLEppendorf管中,加入500μLPBS洗涤, 3000g离心15min,弃上清,编号备用。 6.3.2 羽毛或组织脏器 取待检样品2.0g加入2mLpH7.2的0.01mol/LPBS于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨, 分装编号备用。 2GB/T27644—2011 6.4 样本存放 制备的样本在2℃~8℃条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置-70℃以下,但应避免反复 冻融(冻融不超过3次),淋巴细胞样品在2℃~8℃条件下保存。 7 核酸提取及荧光PCR检测 7.1 注意事项 实验室注意事项见附录C。 7.2 核酸提取 7.2.1 取n个灭菌的1.5mLEppendorf管(n为被检样品之和),编号。 7.2.2 每管加入250μLDNA提取液(参见附录A),然后分别加入被检样本各250μL,一份样本换用 一个吸头,再加入10μL蛋白酶K(1mg/mL),混匀器上振荡混匀,56℃消化2h,加入等体积的三氯甲 烷,混匀,15000g离心15min。 7.2.3 取与7.2.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管,吸取7.2.2各管中的上清液转移至相应的 管中,不能吸出中间层,然后再分别加入等体积的-20℃预冷的异丙醇,颠倒混匀。 7.2.4 15000g离心15min,小心倒去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体;加入800μL75%乙醇,颠倒 洗涤。 7.2.5 15000g离心10min,小心倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体。 7.2.6 5000g离心10s,小心倒去上清,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器将其吸干,室 温干燥5min~10min。 7.2.7 加入10μL灭菌双蒸水,溶解管壁上的DNA,6000g离心5s,4℃保存备用。若需长期保存须 放置-80℃冰箱。 7.3 扩增检测 7.3.1 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。 取出MDVPCR反应液(参见附录A),在室温下融化后,1000g离心5s,每个PCR反应按表1配 制PCR反应混合液(需配制反应液数量=样本个数+阴性对照+阳性对照): 表1 试剂 MDVPCR反应液 Taq酶 用量 21.75μL 0.25μL 将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中,充分混匀,然后在每个PCR管中分装22μL, 转移至样本处理区。 7.3.2 加样 在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸3μL,盖上管盖,将PCR管放 入荧光PCR检测仪内,记录样本放置顺序。 3GB/T27644—2011 7.3.3 PCR扩增检测 在扩增检测区进行。 7.3.4 反应条件设定 第一步:50℃2min,95℃5min; 第二步:95℃5s,60℃45s,40个循环; 60℃时设置采集荧光。 7.3.5 荧光素设定 ReportDye设定为FAM,QuenchDye设定为BHQ(或Tamra或Eclipse);Referencedye设定为 自带校正荧光ROX,如使用其他品牌仪器应设为空白或自带校正。 8 条件设定及结果判定 8.1 条件设定 禽疱疹病毒2型阳性对照和阴性对照质控标准:阳性对照有S型PCR扩增曲线,而且Ct值≤35; 阴性对照无S型PCR扩增曲线,而且Ct值显示为无。否则此次实验结果无效。 8.2 结果判定及描述 8.2.1 Ct值≤35的样本为阳性,表明禽疱疹病毒2型核酸阳性。Ct值显示为无的样本为阴性样本, 表明禽疱疹病毒2型核酸阴性。 8.2.2 对于35<Ct值≤40的样本建议对样品进行复检。若复检后,Ct值≤35,判为禽疱疹病毒2型 核酸阳性,否则判为阴性。 4GB/T27644—2011 附 录 A (资料性附录) 试剂盒的组成及使用说明 A.1 试剂盒组成 每个试剂盒可做48个检测,包括以下成分: GHV2PCR反应液 1.1mL×1管 Taq酶 12.5μL×1管 阴性对照 1.0mL×1管 阳性对照 1.0mL×1管 双蒸水 1mL×1管 DNA提取液 12.5mL×1管 A.2 说明 A.2.1 GHV2PCR反应液(1×):含50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),2.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/LdNTPmix,上、下游引物各20nmol/mL,探针10nmol/mL,1UTaq酶,5%甘油。 A.2.2 DNA提取液主要成分:20mmol/LTris-HCl(pH7.4),200mmol/LEDTA,1%SDS。 A.3 使用时的注意事项 A.3.1 在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染。 A.3.2 反应液分装时应避免产生气泡,