ICS71.040.99 C40 中华人民共和国国家标准 GB/T27765—2011 SiO2、TiO2、Fe3O4及 Al2O3纳米颗粒 生物效应的透射电子显微镜检测方法 TestingmethodsofSiO2,TiO2,Fe3O4andAl2O3nanoparticlesbiologicaleffectby transmissionelectronmicroscope(TEM) 2011-12-30发布 2012-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)提出并归口。 本标准负责起草单位:中国人民解放军第二军医大学、复旦大学及地科院矿产资源研究所。 本标准主要起草人:杨勇骥、俞彰、周健雄、张天宝。 ⅠGB/T27765—2011 SiO2、TiO2、Fe3O4及Al2O3纳米颗粒 生物效应的透射电子显微镜检测方法 1 范围 本标准规定了透射电子显微镜检测含有SiO2、TiO2、Fe3O4及Al2O3纳米颗粒材料的生物试样的 技术和规范。 本标准适用于SiO2、TiO2、Fe3O4及Al2O3纳米颗粒材料的生物效应透射电镜检测的生物薄试样 超微结构分析。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T18873—2008 生物薄试样的透射电子显微镜-X射线能谱定量分析通则 GB/T19619—2004 纳米材料术语 ISO/IEC17025:2005 检测和校准实验室认可准则(Generalrequirementsforthecompetenceof testingandcalibrationlaboratories) 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 纳米颗粒 nanoparticles 纳米尺度的固体粒子。本标准中出现的纳米颗粒材料特指为SiO2、TiO2、Fe3O4及Al2O3纳米颗 粒材料。 3.2 生物效应 biologicaleffect 纳米材料与生命过程的相互作用产生的生理功能、生化功能及形态结构的变化。 3.3 生物效应检测 biologicaltest 采用生物学、化学、毒理学与医学等领域的实验技术进行检验测量。 3.4 生物薄试样 thinbiologicalsample 生物薄试样是指采用超薄切片机切成的、厚度为40nm~100nm的生物试样,用于透射电镜观察。 4 基本原理 纳米颗粒材料的表面理化特性使其易形成团聚,经分散后与生物体接触。纳米颗粒材料与生物体 接触后,需采用超微结构制样方法,将其制成生物薄试样,在透射电镜下检测纳米颗粒材料作用于生物 1GB/T27765—2011 体后产生的细胞及细胞器的超微结构变化,以确定纳米颗粒材料对生物体的生物效应作用。用聚焦的 高能电子束照射生物薄试样的微小区域,入射的电子束大部分透过薄试样,形成透射电子,透射电子中 含有大量携带有生物薄试样内部信息的非弹性散射电子,非弹性散射电子在荧光屏、照相底片或CCD 上成像,形成生物薄试样的超微结构图像。 5 仪器设备和材料 5.1 仪器设备 5.1.1 透射电子显微镜。 5.1.2 超薄切片机。 5.1.3 制刀机。 5.1.4 玻璃刀或钻石刀。 5.1.5 恒温烘箱(30℃~70℃)。 5.1.6 超声波清洗仪。 5.2 材料 5.2.1 戊二醛。 5.2.2 四氧化锇。 5.2.3 乙醇。 5.2.4 丙酮。 5.2.5 环氧树脂。 5.2.6 醋酸双氧铀。 5.2.7 枸橼酸铅。 6 仪器的环境条件 超薄切片机、透射电子显微镜的工作环境应符合以下要求: 6.1 超薄切片机 6.1.1 切片室应为超薄切片专用房间。 6.1.2 相对湿度小于60%。 6.1.3 温度:(20±5)℃。 6.1.4 电源电压:220(1±10%)V。 6.2 透射电子显微镜 6.2.1 电镜室应为电镜专用房间。 6.2.2 相对湿度小于60%。 6.2.3 温度:(20±5)℃。 6.2.4 杂散电磁场干扰应小于0.1μT。 6.2.5 电源电压及频率应稳定[220(1±10%)V,50Hz±1Hz]。 6.2.6 具备仪器专用地线,接地电阻应小于100Ω。 2GB/T27765—2011 7 纳米颗粒材料分散 7.1 将纳米颗粒材料与溶剂按一定的比例充分混和。 7.2 放入超声波清洗仪中分散。 注:建议分散的条件:水温(25~30)℃;功率300W;频率40(1±10%)kHz;时间30min左右。 8 生物薄试样制备 8.1 纳米颗粒材料 8.1.1 将不同浓度、已分散的纳米颗粒悬液滴在有支持膜(一般用火棉胶或Fomvar膜)的ϕ3mm透 射电镜专用载网上。 8.1.2 将滴有纳米颗粒材料悬液的电镜专用载网放入恒温烘箱中,60℃烘烤2h。 8.2 生物组织 8.2.1 取材:将生物组织在(2~3)%戊二醛固定液(4℃)中迅速切成小于1mm3的小块。配制戊二 醛固定液可参考附录C。 8.2.2 前固定:将小块组织浸泡在20倍体积、4℃的(2~3)%戊二醛固定液中固定(1~4)h,用缓冲液 充分漂洗。 8.2.3 后固定:将生物小块组织浸泡在1%锇酸,4℃固定2h。配制锇酸可参考附录D。 8.2.4 脱水:用乙醇或丙酮梯度脱水。建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为:30%、50%、70%、90%乙醇 各一次;90%丙酮1次,100%丙酮3次;每次(10~15)min。 8.2.5 包埋:在按比例配制好的环氧树脂(以Epon812为例,配制比例可参考附录B)中浸透后,在胶囊 (或硅胶包埋板)内进行包埋。建议浸透比例为,丙酮:包埋剂(浸透时间):1∶1[(1~2)h];1∶2(12h); 纯包埋剂(1h)。 8.2.6 聚合:在恒温烘箱内进行聚合,37℃聚合12h后,升温至60℃聚合(36~48)h。 8.2.7 修块:包埋块在进行超薄切片之前,将分析部位修成易于超薄切片的形状。 8.2.8 超薄切片:采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片,厚度一般要求在(40~100)nm。 8.2.9 染色:采用醋酸铀和枸橼酸铅对超薄切片进行双重金属染色后待检。 8.3 培养细胞 8.3.1 前固定:用橡皮刮将细胞从培养皿底部刮下或胰酶消化下来,低速离心(800g,5min)成小团 块,弃上清,沿管壁加入(2~3)%戊二醛固定液,放入4℃冰箱固定(1~4)h。用缓冲液充分漂洗。 8.3.2 后固定:经戊二醛固定的细胞团块用缓冲液轻轻漂洗后,加入1%锇酸,放入4℃冰箱固定1h。 8.3.3 脱水(同8.2.4)。 8.3.4 包埋(同8.2.5)。 8.3.5 聚合(同8.2.6)。 8.3.6 修块(同8.2.7)。 8.3.7 超薄切片(同8.2.8)。 8.3.8 染色(同8.2.9)。 3GB/T27765—2011 9 透射电子显微镜准备工作 9.1 开机,抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定30min以上。 9.2 选择测试生物薄试样所需的加速电压,建议检测生物薄试样所需的加速电压选择在60kV~ 120kV之间。 9.3 调节电子枪的灯丝电流,使束流处于稳定饱和状态。 9.4 对电子光学系统进行对中调整,尽可能消除电子束的像散,使透射电子显微镜处于最佳工作状态。 10 测量分析步骤 10.1 纳米颗粒材料 10.1.1 将干燥的纳米颗粒薄试样放入透射电镜。 10.1.2 在低倍(3000倍~4000倍)下寻找合适的试样部位,要求被分析试样无破损、无污染。 10.1.3 在高倍(40000倍~50000倍)时观察纳米材料的分散情况,测量纳米颗粒的粒径并记录实验 结果。 10.2 生物薄试样 10.2.1 在低倍(小于4000倍)下寻找合适的生物薄试样部位,要求被分析试样无破损、无污染、无震 颤条纹。 10.2.2 将确定的试样分析部位置于电子显微镜的观察中心。 10.2.3 逐步增加放大倍数(一般放大倍数在10000~30000即可,少数需放大30000倍以上),寻找 细胞内外、细胞器内外有无纳米材料。 10.2.4 仔细分析纳米材料分布的位置,注意区分样品制备过程中引入的污染物和纳米颗粒材料。如 果无法判别,建议采用X射线能谱分析对颗粒物进行定性分析,分析方法参见GB/T18873—2008。 10.2.5 精确聚焦并存储实验结果。 11 分析结果的发布 分析结果报告应包括以下信息(参见附录A),亦可参照ISO/IEC17025:2005中有关分析报告 格式。 11.1 分析报告的惟一编号。 11.2 送样人姓名,单位和地址。 11.3 样品的接收日期。 11.4 分析仪器及其工作条件。 11.5 分析结果和必要的说明。 11.6 分析报告负责人的签字。 11.7 分析报告的页码。 11.8 实验室名称和地址。 11.9 分析报告的日期。 4GB/T27765—2011 附 录 A (资料性附录) SiO2、TiO2、Fe3O4及Al2O3纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜分析结果报告 报告编号: 送样单位: 送样日期: 样品内容: 检测内容与要求: 送样人姓名: 送样人联系电话: 送样人E-mail地址: 测量条件: 仪器型号: 仪器条件: 加速电压: 检测结果: 倍率标尺: 分析结果: 必要的说明: 分