ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27980—2011 马 病毒性动脉炎诊断技术 Diagnostictechniquesforequineviralarteritis 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室。 本标准主要起草人:张念祖、杨仕标、宋建领、杜健、王金萍、朱建波、李华春。 ⅠGB/T27980—2011 马病毒性动脉炎诊断技术 1 范围 本标准规定了马病毒性动脉炎诊断技术。 本标准适用于马病毒性动脉炎的诊断和检疫。其中病毒分离、琼脂糖凝胶免疫扩散试验、反转录聚 合酶链式反应试验适用于马病毒性动脉炎的病原诊断,中和试验和酶联免疫吸附试验适用于马病毒性 动脉炎的抗体检测。 2 临床诊断 2.1 流行病学 马病毒性动脉炎是由马动脉炎病毒所引起的一种马的散发性呼吸系统和繁殖系统的接触性传染 病,该病只感染马属动物,主要是通过生殖系统和呼吸系统而感染传播。公马带毒后无明显临床症状, 却是危险的传染源。长期带毒的种公马可通过自然交配或人工授精的方式把病毒传给母马。流产马的 胎盘、胎液、胎儿亦可传播本病。患病马在急性期通过呼吸道分泌物将病毒传给同群马或与其相接触的 马。通过用具、饲料和饲养人员的接触也能将病毒传给易感马。该病呈世界性分布,血清学试验证实, 我国也存在该病。 2.2 临床症状 患马可表现为临诊症状和亚临诊症状,大多数自然感染的马表现为亚临诊症状。试验感染潜伏期 为1d~6d,野外感染普遍为3d~4d。本病的典型症状是发热,一般感染后3d~14d体温升高达 41℃,并可持续5d~9d。表现厌食、精神沉郁、四肢严重水肿,步伐僵直,眼、鼻分泌物增加,后期为脓 性粘液,发生鼻炎和结膜炎。面部、颈部、臀部形成皮肤疹块。公马的阴囊和包皮水肿,马驹和虚弱的马 可引起死亡。怀孕母马流产,其流产率可达90%以上。流产发生在感染后的10d~30d,通常出现在临 诊发病期或恢复早期。胎儿常在流产前就死亡,流产胎儿水肿,呼吸道粘膜和脾被膜上有出血点。母马 痊愈后很少带毒,而大多数公马恢复后则成为病毒的长期携带者。这些症状并不是在同一马群中同时 出现。马驹、老龄雌马和营养状况差的马,临床症状较重,孕马比空怀母马明显。除极少数患马发生死 亡外,一般为轻度临床症状。 2.3 病理变化 死亡病例最主要的剖检变化是全身较小动脉管内肌层细胞的坏死,内膜上皮的病变导致特征性的 出血和水肿以及血栓形成和梗死。常见大叶性肺炎和胸膜渗出物,发生全身性动脉炎的结果,所有浆膜 和粘膜以及肺和中膈等都有点状出血。肾上腺上也有出血,在心、脾、肺、肾、怀孕母马的子宫、眼结膜、 眼睑、膝关节或跗关节以下的皮下组织以及阴囊和睾丸内,均能发现出血及水肿变化。恢复期病马的慢 性损害包括广泛性全身性动脉炎和严重的肾小球性肾炎。实验感染后观察到的损伤可分成3个型,即 发展(渐进)型、终末(端)型及慢性活动型。从感染后4d~6d观察发展(渐进)型损伤,发现胸腹水过 多,淋巴结充血肿大,结肠到盲肠脉管水肿,大肠粘膜下淋巴结肿大,还可见粘膜上皮温和坏死。终末 (端)型损伤被认为是发展(渐进)型损伤的延伸,表现为皮下水肿,胸腔大量积液,全身所有淋巴结肿胀 到不同程度的出血,盲肠和结肠有梗死。粘膜下严重水肿和出血,有时可见肾上腺皮质出血。病毒接种 1GB/T27980—2011 后第12天,可见慢性损伤,包括温和性淋巴结肿胀及胸腔内积液过多。实验感染后观察到的损伤的严 重性很少与自然感染的损伤一样。 2.4 诊断 依据上述流行病学特点、临床症状和病理剖检变化特征等可作出初步诊断,确诊后应该通过实验室 病原学和血清学诊断。 3 病毒分离 3.1 器材和设备 单道微量加样器(0.5μL~10μL、5μL~10μL、40μL~200μL、200μL~1000μL)及滴头。 -80℃冰箱,二氧化碳培养箱。组织研磨器、超声波振荡器、低速离心机、倒置显微镜。 3.2 试剂与材料 血(采自血管);细胞:兔肾细胞(RK-13);细胞培养液(见附录A)。 3.3 病毒分离 3.3.1 样品的采集 急性病例采取脱纤全血或沉淀白细胞层,鼻分泌物、结膜拭子或流产胎儿的体液及脾脏,被检种马 的精液;尸体剖检时采取肺、脾和淋巴结,将病料置于含1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的 0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)里。这些病料应立即用冰冷却,若不立即接种,应将病 料迅速冻存于-80℃冰箱。精液的采集:使用一次射精时精子数量最多的部分精液。 3.3.2 样品的处理 组织样品用含1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的细胞培养液按1∶10的比例,置于研 磨器中剪碎并研磨。将已研磨好的待检病料,4℃1000r/min离心5min,取上清液;分泌物和排泄物 样品的处理,将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子,4℃1000r/min离心5min,取上清液;精液冻融3次 或超声波裂解处理(100μA、1min~2min),用细胞培养液作1∶10的稀释,4℃1000r/min离心 5min,取上清液。 将处理好的样品上清液用0.22μm滤器过滤除菌,待用。 3.3.3 接种细胞 将样品悬液接种于RK-13细胞,每份样品接种5瓶,每瓶(生长面积25cm2)接1mL,37℃吸附 1h,再加5mL维持液。将接种细胞置于37℃、5%二氧化碳条件下培养12d,每2d~3d换维持液 一次。 3.3.4 观察与传代 接种后用倒置显微镜逐日观察细胞是否出现细胞病变(CPE),出现者收获,无CPE者再盲传3代, 仍无细胞病变者弃之。 3.3.5 病毒增殖、分装与保存 RK-13细胞上出现CPE的病毒悬液用1mL无菌小管分装,作为原始毒置于-80℃冰箱或液氮罐 2GB/T27980—2011 中保存。 将原始毒接种RK-13细胞,37℃、5%二氧化碳条件下培养并逐日观察细胞病变,70%以上细胞出 现病变时收集细胞病毒液,按1mL每小管进行无菌分装,置-80℃冰箱保存备用。 病毒鉴定按本标准琼脂糖凝胶免疫扩散试验(AGID)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法 进行。 4 琼脂糖凝胶免疫扩散试验(AGID) 4.1 材料和器械 4.1.1 器械:直径6cm平皿、外径4mm打孔器、加样器。 4.1.2 阳性血清、标准马病毒性动脉炎高免血清。 4.1.3 阴性血清:无马病毒性动脉炎抗体和细胞毒性的健马血清。 4.1.4 标准抗原:纯化浓缩的马病毒性动脉炎病毒。 4.1.5 待检抗原:抗原应无污染,取少量样品加最少量的无菌生理盐水磨碎后作为待检抗原;病毒分离 物浓缩(用聚乙二醇8000做100倍浓缩)后亦可作为待检抗原。 4.2 试验方法 4.2.1 琼脂平皿的制作(所用试剂均为常规分析纯试剂):见附录B。 4.2.2 打孔:用直径4mm金属打孔器在已凝固的琼脂糖凝胶平皿上打孔,孔距为3mm,打孔后用针 挑出切下的孔内琼脂块。 4.2.3 加样:用微量加样器或毛细吸管,吸取抗原或血清加于孔内,中央孔滴加标准阳性血清,周围的 第1孔、第3孔、第5孔滴加对照阳性抗原,第4孔滴加阴性抗原,第2孔、第6孔滴加样品(待检抗原), 加样量以加满不溢出为度。加样后静置10min,放入湿盒内37℃进行反应。24h后观察并记录结果。 4.3 结果判定 结果判定时将琼脂平皿置暗背景或侧强光照射下观察,若对照阳性抗原与标准阳性血清孔之间出 现一条清晰、明显的白色沉淀线,而对照阴性抗原与标准阳性血清孔之间无沉淀线则认为试验可以成 立,如果沉淀线没有或不明显则本试验不能成立,应该重做。结果判定标准如下: a) 阳性:待检抗原孔与阳性血清孔之间出现明显清晰白色沉淀线,并与标准阳性孔的沉淀线相 融合。 b) 阴性:待检抗原孔与阳性血清孔之间无沉淀线,标准阳性孔抗原的沉淀线直伸被检样品的孔 边,判为阴性。 4.4 限制性说明 本方法仅用于马病毒性动脉炎(EVA)病原的普查,可能会出现非特异性反应。建议对AGID阳性 样品进行进一步的病原或者核酸诊断。 5 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 5.1 仪器和设备 PCR(聚合酶链式反应)扩增仪、台式低温离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外灯、紫外凝胶成像仪、 3GB/T27980—2011 单道微量加样器(0.5μL~10μL、5μL~10μL、40μL~200μL、200μL~1000μL)及滴头,PCR仪和离 心管。 5.2 试剂与材料 5.2.1 材料:细胞病毒液或病料组织、外周血液或鼻分泌物。 5.2.2 试剂:柱离心式小量病毒RNA&DNA抽提试剂盒,核糖核酸聚合酶链式反应试剂盒(逆转录 RNAPCRKit),上样缓冲液(1%SDS,50%甘油和0.05%溴酚蓝)、溴化乙锭(EB)储存液(10μg/mL)、 琼脂糖,DNA分子质量标准,异丙醇等均为常规分析纯试剂,电泳缓冲液(配制方法见附录C)。 5.2.3 引物:在马病毒性动脉炎病毒ORF1b的9282bp~9466bp片段设计引物 CI:5-CCTGAGACACTGAGTCGCGT-3 DI:5-CCTGATGCCACATGGAATCA-3 扩增目的片段为184bp。 5.3 操作程序 5.3.1 样品的采集和处理 样品的采集和