ICS65.020.01 CCSB16 中华人民共和国国家标准 GB/T28062—2025 代替GB/T28062—2011 柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测 技术规程 CodeofpracticefordetectionofCandidatusLiberibacterasiaticus byquantitativereal-timePCR 2025-05-30发布 2025-12-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T28062—2011《柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法》,与GB/T28062—2011 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———更改了黄龙病样本的取样方法(见9.1,2011年版的8.2); ———更改了阳性对照的Ct值规定(见11.3.2,2011年版的10.2.2); ———将韧皮部杆菌亚洲种的荧光染料法检测引物CQULasF04/CQULasR04更改成特异性更高的 CLas-4G/HLBr(5'-AGTCGAGCGCGTATGCGAAT-3'/5'-GCGTTATCCCGTAGAAAAA GGTAG-3'),并增加了荧光标记探针HLBp(序列为5'-AGACGGGTGAGTAACGCG-3') (见10.1,2011年版的F.1.1); ———增加了靶标韧皮部杆菌亚洲种核苷酸还原酶β基因(nrdB基因)的实时荧光PCR检测 (见11.3.3)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本文件起草单位:全国农业技术推广服务中心、华南农业大学、西南大学柑桔研究所。 本文件主要起草人:冯晓东、陈冉冉、邓晓玲、郑正、王雪峰、周常勇。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2011年首次发布为GB/T28062—2011; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T28062—2025 柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测 技术规程 1 范围 本文件确立了柑橘黄龙病病原韧皮部杆菌亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus)实时荧光定 量PCR检测程序,规定了实验室设置、样品采集与处理、检测操作方法和结果判定,描述了证实方法。 本文件适用于对黄龙病寄主植物和传病媒介柑橘木虱中韧皮部杆菌亚洲种的实时荧光定量PCR 检测和病害鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB5040 柑桔苗木产地检疫规程 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 柑橘黄龙病 CitrusHuanglongbing 由韧皮部杆菌CandidatusLiberibacterspp.引起的植物检疫性病害,对柑橘生产造成巨大损失。 注:韧皮部杆菌属原核生物、α-变形菌纲、根瘤菌目(Rhizobiales)、根瘤菌科(Rhizobiaceae),韧皮部杆菌属 Liberibacter,是一种难培养革兰氏阴性细菌,分为3个种:分布于亚洲、非洲及美洲的韧皮部杆菌亚洲种Candi- datusLiberibacterasiaticus;分布于非洲的韧皮部杆菌非洲种CandidatusLiberibacterafricanus以及分布于南 美洲的韧皮部杆菌美洲种CandidatusLiberibacteramericanus。 3.2 实时荧光定量PCR quantitativereal-timePCR 在体外扩增微量DNA片段的方法,在扩增过程中由于荧光物质的释放或荧光物质与扩增产物结 合而释放荧光信号,通过对荧光信号积累的实时监测来实现对起始模板中的靶标DNA的定量分析。 3.3 Ct值 cyclethresholdvalue 实时荧光PCR反应中每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 4 方法原理 本文件采用的实时荧光定量PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。荧光染料 法是利用黄龙病菌特有DNA序列设计引物,在PCR扩增时加入荧光染料,荧光染料与扩增形成的产 1GB/T28062—2025 物-DNA双链结合而发出荧光,被检测器实时检测以判定检测样品的初始菌量。荧光探针法是在合成 特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针,探针5'端和3'端分别标记荧光素报告基团和猝 灭基团,如果反应体系中存在待测目标DNA模板,引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结 合,当PCR扩增延伸到探针结合部位时,TaqDNA聚合酶将探针水解成单核苷酸,使标记在探针上的 报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测以判定检测样品的初始菌量。由于初始模板量的 不同,反应管内的荧光物质达到设定的可检测阀值时所经历的Ct值不同,因此Ct值可以用于判定检测 样品的初始菌量。 5 实验室设置 实验室应依次分为三个相对独立的工作区域: a) 样本制备区; b) 反应试剂配制区; c) 检测区。 每个工作区域应有明确标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用。 6 仪器设备 实时荧光PCR仪(激发/检测波长范围350nm~750nm),可用SYBRGreenI染料和TaqMan探 针;升降温速度≥2.0℃;均一性±0.5℃;准确性±0.3℃;温度范围4℃~100℃;高速台式离心机(离 心力12000g以上);生物安全柜或超净工作台;电子天平(感量0.01g);核酸蛋白定量分析仪;冰箱 (2℃~4℃、-20℃、-80℃);涡旋混匀仪;紫外灭菌灯;微量可调移液器(0.5μL~10μL、10μL~ 100μL、100μL~1000μL)等。 7 试剂与材料 7.1 试剂 所需试剂包括:次氯酸钠(NaClO3)、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K(ProteinaseK)、三羟甲基氨 基甲烷(Tris)、乙二氨四乙酸(EDTA)、盐酸胍(GuanidingeHCl)、无水乙醇(Ethanol)、实时荧光定量 PCR混合试剂[Real-timePCRMasterMix,包括荧光PCR反应液(含TaqDNA聚合酶)]。除有特殊 说明外,所有实验用试剂均为分析纯,实验用水符合GB/T6682的一级水指标。 7.2 材料 7.2.1 韧皮部杆菌亚洲种的检测引物 5'-引物:5'-AGTCGAGCGCGTATGCGAAT-3'。 3'-引物:5'-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3'。 7.2.2 TaqMan探针 5'-AGACGGGTGAGTAACGCG-3'。 7.2.3 阳性对照 用已知带有韧皮部杆菌亚洲种的柑橘样品作阳性对照。 2GB/T28062—2025 7.2.4 阴性对照 用已知健康的柑橘样品作阴性对照。 7.2.5 空白对照 用无菌一级水代替样品。 8 检测程序 柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测程序包括5个阶段,流程图见图1。 图1 柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测流程图 9 样品的采集与处理 9.1 取样方法 9.1.1 产地检疫取样 产地检疫田间实地取样按照GB5040的规定执行。 9.1.2 叶片样品 疑似病树优先采集疑似斑驳黄化症状的叶片,如无典型症状,按树冠东南西北四方采集,每点取上 中下部叶片各1片,每棵树共采集叶片12片。种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株(无症材料) 10株,每株取上中下部叶片3片,共30片。 接穗等繁殖材料按规程规定的比例抽取样品。 黄龙病病害症状见附录A。 9.1.3 果实样品 幼果期采样和商品鲜果取样,切取果柄、果蒂和橘络。 9.1.4 传病媒介柑橘木虱样品 在柑橘新梢抽发期,每株树采集一定数量成虫或3龄以上若虫,采样点可随机分散果园;口岸或调 3GB/T28062—2025 运种苗、接穗等材料中发现的木虱则直接收集。用75%(体积分数)乙醇浸泡固定30min,放入1.5mL 离心管封装。样品采集后立即装入样品袋[木虱样品可用75%(体积分数)乙醇杀死固定后,装入微量 离心管],并按照要求填写采样记录,记载样品来源、品种、目测症状、采样人、采样地、采样时间等及时送 指定检测实验室。柑橘木虱鉴定见附录A。 9.2 样品贮运与保存 采集的植株样品用样品袋分装,柑橘木虱用乙醇固定的可用离心管分装,与采集记录一并寄送指定 实验室检测。检测后余下的植物材料和柑橘木虱样品可置于4℃条件下保存7d,以备复测的需要。无 需保存的样品应立即进行无害化灭菌处理。保存完整、未腐烂的叶片、果实样本及柑橘木虱样本进入样 品DNA提取。 9.3 样品DNA提取 样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行。制备好的DNA样本在4℃条件下保存应不超过 7d,在-20℃冻存不超过30d,避免反复冻融。 按附录B执行样品处理试剂配制及样品DNA提取。质量符合要求的样品DNA进入韧皮部杆菌 亚洲种实时荧光定量PCR扩增。 10 韧皮部杆菌亚洲种实时荧光定量PCR扩增 10.1 扩增试剂配制(在反应试剂配制区进行) 10.1.1 用无菌超纯水配制韧皮部杆菌亚洲种16SrRNA基因特异性引物对CLas-4G/HLBr母液(用 于荧光染料法和荧光探针法,引物序列为:5'-AGTCGAGCGCGTATGC