ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28068—2011 柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法 DetectionofXanthomonascitrisubsp.citriusingthereal-time fluorescentPCR 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:重庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:王中康、殷幼平、王福祥、高文娜、夏玉先、李正国、曹月青。 ⅠGB/T28068—2011 柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法 1　范围 本标准规定了柑桔溃疡病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri,Xcc)的实时荧光PCR检测的样品制 备、检测技术、操作方法及结果判定标准。 本标准适用于柑桔植物材料中柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB5040　柑桔苗木产地检疫规程 GB/T19495.2　转基因产品检测　实验室技术要求 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 柑桔溃疡病　citruscankerdisease 由柑桔溃疡病菌引起的国内外柑桔检疫性细菌病害。症状特征表现为柑桔叶片、枝条和果实表面 出现隆起的木栓化溃疡病斑,造成柑桔落叶落果、树势衰弱,严重影响柑桔产量与果品外观质量。 3.2 柑桔溃疡病菌　Xanthomonascitrisubsp.citri 指引起亚洲型柑桔溃疡病的病原细菌,为黄单胞菌属的柑桔黄单胞柑桔亚种新组合(Schaad2006; Young2008)。 3.3 实时荧光PCR　real-timefluorescentPCR 实时荧光聚合酶链式反应,一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法,在扩增过程中由于荧光 物质的释放并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。 3.4 扩增引物　primer 人工合成的寡核苷酸序列,其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同,用于引导DNA体外 扩增。 3.5 扩增模板　templet DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。 3.6 Ct值　cyclethresholdvalue 实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 1GB/T28068—2011 3.7 柑桔溃疡病菌重组质粒 利用特异性引物扩增柑桔溃疡病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri)基因组模板,获得的柑桔溃疡 菌特异性DNA扩增序列构建重组质粒,将该重组质粒转导到大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后,重 新提取出获得的质粒DNA。用于作为柑桔溃疡病菌检测的阳性对照。 4　柑桔溃疡病菌基本信息 拉丁学名:柑桔黄单胞菌柑桔亚种Xanthomonascitrisubsp.citriGabrielet.al(1989)。 病害名称:柑桔溃疡病citruscancerdisease。 分类地位:假单胞菌科Pseudomonaceae、黄单胞菌属Xanthomonas,柑桔黄单胞Xanthomonas citri[Gabrielet.al(1989)]。 主要分布于亚洲的中国,印度和东南亚,美洲的美国、巴西、乌拉圭、巴拉圭和阿根廷等国家和地区。 葡萄柚、甜橙、柠檬、莱檬、柑桔和枳等柑桔种和品种。带菌种苗、接穗及商品果实是远距离传播的主要 途径;田间则主要由夹风雨和农事操作传播。 柑桔溃疡病菌其他信息参见附录A。 利用柑桔溃疡病菌亚种通用引物对XccF05/XccR05,以常规PCR方法可以检测出柑桔材料中柑 桔黄单胞柑桔亚种(A菌系)和褐色黄单胞莱檬亚种(BC/D菌系)(检测引物、检测方法及结果判定参见 附录B)。 5　方法原理 本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是,利用 病菌特有DNA序列设计引物,在PCR扩增时加入荧光染料,荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结 合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法),或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双 标记探针,探针5’端和3’端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团,如果反应体系中存在待测目标DNA 模板,引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合,当PCR扩增延伸到探针结合部位时,Taq DNA聚合酶将探针水解成单核苷酸,使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实 时检测(荧光探针法)。由于初始模板量的不同,反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历 的Ct值不同,因此Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量。 6　实验室设置 柑桔溃疡病菌PCR检测实验室主要参照GB/T19495.2设置与管理。检测实验室应至少分为三 个相对独立的工作区域:样本制备区、反应试剂配制区和检测区;每个工作区域应有明确标记,避免不同 工作区域内的设备、物品混用。 7　材料与试剂 7.1　仪器与器材 7.1.1　实时荧光PCR仪。 7.1.2　高速台式离心机。 7.1.3　生物安全柜或超净工作台。 2GB/T28068—2011 7.1.4　冰箱(冷藏室4℃和冷冻室-20℃)。 7.1.5　涡旋混匀仪。 7.1.6　紫外灭菌灯。 7.1.7　微量可调移液器(0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL)。 7.1.8　带滤芯Tip头。 7.1.9　PCR反应管(0.2mL八联管)。 7.1.10　微滤柱。 7.1.11　高压灭菌锅。 7.2　试剂 7.2.1　磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)。 7.2.2　磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)。 7.2.3　三羟甲基氨基甲烷(Tris)。 7.2.4　乙二胺四乙酸(EDTA)。 7.2.5　实时荧光PCR混合试剂(Real-timePCRMasterMix)。 8　采样及样品处理 8.1　采样及样品处理工具 8.1.1　样品袋:牛皮纸袋或信封(一次性使用)。 8.1.2　枝剪。 8.1.3　剪刀,镊子。 8.1.4　塑料离心管(1.5mL,50mL)。 8.1.2~8.1.4的取(制)样工具应经121℃±2℃,15min高压蒸汽灭菌。田间取样每个样品采集 后或实验室处理每个不同样品后,工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上,以避免样品间相互污染。 8.2　取样方法 8.2.1　田间采集 田间实地取样参照GB5040。 取带有柑桔疑似溃疡病病斑的柑桔叶片、嫩梢和果实样品(柑桔溃疡病症状特征参见附录A)。 8.2.2　口岸检疫及调运检疫抽样 种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株(无症材料)10株,每株取叶片5片,共50片;接穗等 材料则随机直接抽取10份材料;商品果采集带有疑似病斑的果实。 样品采集后立即装入样品袋。按规定编号密封后,做好相关记载,包括样品品种、目测症状、采样 人、采集地、采集时间等。及时寄送检测实验室。 8.3　样品存放 采集的植物材料若需短暂保存,应置于4℃条件下,可保存1周。检测后余下的植物材料应置于 4℃条件下保存7d,以备复测的需要。 8.4　样品DNA制备操作 样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行。所制备的DNA样本在4℃条件下保存应不超过 3GB/T28068—2011 7d,在-20℃冻存不超过30d,避免反复冻融。 样品制备的具体操作过程见附录C。 9　PCR检测操作 9.1　所用引物对与探针 荧光染料法PCR检测所用特异性引物对CQUXccF02/CQUXccR02,序列为CQUXccF02: 5’-ACGAGAAAGAACTTCGCCCC-3’,CQUXccR02:5’-TCTGACCACATCGCATAGGA-3’。 荧光探针法PCR检测所用特异性引物对CQUXccF06/CQUXccR06,序列为CQUXccF06: 5’-GCGGCTATTGGCTGACTTCA-3’和CQUXccR06:5’-GTAGGGCGGACCTTGGGAT-3’。 荧光标记探针CQUXccP1,序列为5’-TCCTCCATAACGAACTCGCAAGGCACG-3’。 9.2　扩增准备 PCR扩增反应体系为25μL。准备PCR扩增反应管,分别加入反应液23μL,最后加入制备的待测 样品2μL。每个样品设置3次重复。每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。 9.3　扩增过程 扩增过程中,设置每次循环的延伸阶段采集荧光。 荧光染料法检测应在扩增结束后立即进行熔解曲线分析,以验证扩增的特异性。熔解曲线的反应 程序为:97℃,1min;57℃,1min;从57℃开始每升高0.5℃保持10s,连续升高80次(到97℃ 为止)。 检测结束后,根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果。 实时荧光PCR扩增的准备及扩增具体操作过程见附录D(不同PCR仪具体程序参数可能稍有 调整)。 推荐使用柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测试剂盒。试剂盒组成、功能及使用注意事项参见附 录E。 10　结果判定及描述 10.1　结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况自动调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品 扩增曲线的最高点为准。 10.2　质控标准