ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28071—2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofcucumbergreenmottlemosaicvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:陈青、陈红运、廖富荣、林石明、吴冰冰、冯黎霞、张永江。 ⅠGB/T28071—2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子、苗木及其产品的检疫鉴定。 2　黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息 中文名:黄瓜绿斑驳花叶病毒。 学名:cucumbergreenmottlemosaicvirus。 缩写:CGMMV。 属烟草花叶病毒属Tobamovirus成员。 CGMMV可通过接触传播,也可通过种子传播。蚜虫等常见瓜类病毒的传播介体不能传播 CGMMV。嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一。植株一旦发病,如果未进行杀灭处理,土 壤也可带毒,带毒土壤也可成为病害发生的侵染源。 黄瓜绿斑驳花叶病毒的其他信息参见附录A。 3　方法原理 通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、体外反转录和体外DNA合 成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),并根据生物学特性进行检测鉴定。 4　仪器设备、用具及试剂 4.1　仪器设备 洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平(感量0.001g)、超净工作台、旋涡混合仪、PCR 仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅。 4.2　用具 微量移液器(0.5μL,2μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL)、化学PGR反应管和(或)96孔 光化学PCR反应板、酶联板、研钵。 4.3　试剂 4.3.1　酶联测定试剂(见附录B)。 4.3.2　RT-PCR检测试剂(见附录C)。 4.3.3　实时荧光RT-PCR检测试剂(见附录D)。 4.3.4　生物学测定(参见附录E)。 1GB/T28071—2011 5　样品制备 5.1　种子样品制备及检疫鉴定 挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中,待长出3片~4片叶后将表现症状 的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成两份,分别用于酶联测定 和分子生物学检测。 也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。 5.2　苗木检验鉴定 有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测,分组方法和检测方法同5.1。 5.3　植物产品的检验鉴定 植物产品有症状的部分(如:果实上的畸形、斑驳等)单独检测。没有症状或无法观察症状的植物产 品,应按比例取样,检测方法为酶联测定和分子生物学检测。 6　检测方法 6.1　双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把制备的样品上清液加入已包被CGMMV抗体的96孔酶联板中,进行DAS-ELISA检测。每个 样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照,感染CGMMV的植物组织作阳性对照,样品提 取缓冲液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检测样品一致。 具体操作见附录B。 6.2　RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对 照,感染CGMMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照。 具体操作见附录C。 6.3　实时荧光RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA,进行实时荧光RT-PCR检测。健康的植物组织作阴性对照,感染 CGMMV的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照。 具体操作见附录D。 6.4　生物学接种试验 参见附录E。 7　结果判定 6.1、6.2、6.3、6.4中如果两种方法的检测结果为阳性,即可判断该批种子或苗木携带黄瓜绿斑驳 花叶病毒。—般是酶联测定为阳性后,RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性即可判断为携带 黄瓜绿斑驳花叶病毒。必要时可进行生物接种试验。 2GB/T28071—2011 8　样品保存 经检验确定携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品应在合适的条件下保存,种子保存在4℃,病株在 -20℃或者-80℃冰箱中保存,做好标记和登记工作。 9　结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等,并要有经手人和检测人员 的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据,RT-PCR检测应有扩增结果图片,生物学接种应有症状 照片。 3GB/T28071—2011 附　录　A (资料性附录) 黄瓜绿斑驳花叶病毒简介 A.1　寄主范围 黄瓜绿斑驳花叶病毒在自然界主要侵染西瓜(Citrulluslanatus)、甜瓜(Cucumismelo)、黄瓜 (Cucumissativus)、南瓜(Cucurbitamoschata)、瓠子(Iagenariasiceraria)、丝瓜(Luffacylindrica)、 苦瓜(Momordicacharantia)等葫芦科植物。一些杂草也是CGMMV的寄主,主要包括北美苋 (Amaranthusblitoides)、反枝苋(Amaranthusretroflexus)、天芥菜(Heliotropiumeuropaeum)、马齿 苋(Portulacaoleracea)、龙葵(Solanumnigrum)等。 A.2　病害症状 黄瓜:叶片斑驳并凸起,畸形,植株矮化,果实上可产生黄或银色条斑,果实严重受损。 西瓜:受侵染叶片轻型叶斑驳,严重时出现疱斑,植株矮化,成熟期果实表面出现浓绿色圆斑,果肉 变色和腐烂。 甜瓜:茎端新叶出现黄斑,随叶片老化症状减轻。 瓠子:叶片出现花叶,有绿色突起,脉间黄化,叶脉呈绿带状。 A.3　分布地区 CGMMV于1935年在英国首次发现和报道。目前在英国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、印度、沙特阿拉伯、 丹麦、德国、俄罗斯、保加利亚、捷克、巴西、爱尔兰、摩尔多瓦、瑞典、芬兰、韩国、朝鲜、以色列、波兰、 日本、巴基斯坦和我国的大陆和台湾均有分布。 A.4　血清学特性 CGMMV具有很强的免疫原性。 A.5　粒体形态 黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体为直杆状,长度为300nm,直径为18nm。 A.6　基因组 病毒基因组为正单链RNA,全长约6.4kb,编码4个蛋白;病毒基因组5’和3’端分别含有一段非 编码区。 4GB/T28071—2011 附　录　B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 B.1　试剂 B.1.1　包被抗体 特异性的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体。 B.1.2　酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体。 B.1.3　底物 对硝基苯磷酸二钠(ρNPP)。 B.1.4　PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4) NaCl　　　　　　　　　8.0g Na2HPO4　　　　　　1.15g KH2PO4　　　　　　　0.2g KCl　　　　　　　　0.2g Tween-20　　　　　　0.5mL 加入900mL蒸馏水溶解,用NaOH或HCl调节pH值到7.4,蒸馏水定容至1L。 每升PBS中加入0.5mL的Tween-20。 B.1.5　样品抽提缓冲液(pH7.4) PBST　　　　　　　　　　　　　1L Na2SO3　　　　　　　　　　　　1.3g PVP(MW24000~40000)　　　20g NaN3　　　　　　　　　　　　　0.2g 用NaOH或HCl调节pH值到7.4。4℃储存。 B.1.6　包被缓冲液(pH9.6) Na2CO3　　　　　　　1.59g NaHCO3　　　　　　2.93g NaN3　　　　　　　　0.2g 加入900mL蒸馏水溶解,用HCl调节pH值到9.6,蒸馏定容至1L。4℃储存。 B.1.7　酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4) PBST　　　　　　　　　　　　　　　　　　1L BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉　　　　　2.0g 5GB/T28071—2011 PVP(MW24000~40000)　　　　　　　20.0g NaN3　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.2g 用NaOH或HCl调节pH值到7.4。4℃储存。 B.1.8　底物(ρNPP)缓冲液(pH9.8) MgCl2　　　　　　　　0.1g NaN3　　　　　　　　0.2g 二乙醇胺　　　　　　97mL 溶于800mL蒸馏水中,用HCl调pH值至9.8,蒸馏水定容至1L。4℃储存。 B.2　程序 B.2.1　包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,100μL/孔,加盖,室温避光孵育4h或4℃ 冰箱孵育过夜,清空酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次~6次。 B.2.2　样品制备 待测样品按1∶10(质量∶体积)加入抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,2000r/min,离心10min,上清 液即为制备好的检测样品。样品提取缓冲液作空白对照,阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明 书进行。 B.2.3　加样 加入制备好的检测样品、空白对照、阴性对照、阳性对照,100μL/孔,加盖,室温避光孵育2h或4℃冰 箱孵育过夜,清空酶