ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28080—2011 小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofTilletiaindicaMitra 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布目　　次 前言 Ⅰ ………………………………………………………………………………………………………… 1　范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2　规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3　小麦印度腥黑穗病菌基本信息 1 ………………………………………………………………………… 4　方法原理 1 ………………………………………………………………………………………………… 5　检疫鉴定流程 1 …………………………………………………………………………………………… 6　取样方法 3 ………………………………………………………………………………………………… 　6.1　未经加工小麦取样方法 3 …………………………………………………………………………… 　6.2　加工小麦取样方法 3 ………………………………………………………………………………… 　6.3　袋装面粉抽样比例 3 ………………………………………………………………………………… 7　主要仪器设备和试剂 3 …………………………………………………………………………………… 　7.1　主要仪器设备 3 ……………………………………………………………………………………… 　7.2　主要试剂 4 …………………………………………………………………………………………… 8　检测与鉴定 4 ……………………………………………………………………………………………… 　8.1　样品前处理 4 ………………………………………………………………………………………… 　8.2　形态学鉴定 5 ………………………………………………………………………………………… 　8.3　单个冬孢子直接分子检测 5 ………………………………………………………………………… 　8.4　孢子培养物的分子检测 5 …………………………………………………………………………… 　8.5　序列测定与比对 5 …………………………………………………………………………………… 9　结果判断与表述 5 ………………………………………………………………………………………… 　9.1　形态学鉴定结果判断和表述 5 ……………………………………………………………………… 　9.2　单个孢子直接分子检测结果判断和表述 5 ………………………………………………………… 　9.3　孢子培养物分子检测结果判断和表述 6 …………………………………………………………… 　9.4　序列测定与比对 6 …………………………………………………………………………………… 10　样品和原始数据保存 6 …………………………………………………………………………………… 　10.1　样品保存 6 …………………………………………………………………………………………… 　10.2　原始数据保存 6 ……………………………………………………………………………………… 附录A(资料性附录)　小麦印度腥黑穗病菌其他信息 7 ………………………………………………… 附录B(规范性附录)　形态学鉴定 9 ……………………………………………………………………… 附录C(资料性附录)　小麦印度腥黑穗病菌与近似种的孢子显微形态图和扫描形态图 10 …………… 附录D(规范性附录)　单个冬孢子直接分子检测 12 ……………………………………………………… 附录E(规范性附录)　孢子培养物常规PCR检测 14 …………………………………………………… 附录F(规范性附录)　孢子培养物实时荧光PCR检测 16 ……………………………………………… 附录G(规范性附录)　序列测定与比对 18 …………………………………………………………………GB/T28080—2011 前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:章桂明、程颖慧、王颖、陆清、凌杏元、龙海、陈枝楠、向才玉、杨伟东、缪建锟。 ⅠGB/T28080—2011 小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了小麦印度腥黑穗病菌的检疫鉴定方法,包括形态学方法和分子生物学检测方法,规定 了小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程,明确了取样和样品保存方法。 本标准适用于小麦及其加工产品传带的小麦印度腥黑穗病菌的检测。 本标准也适用于除小麦以外的该病菌其他寄主传带小麦印度腥黑穗病菌的检测。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18085　植物检疫　小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 GB/T19495.2　转基因产品检测　实验室技术要求 3　小麦印度腥黑穗病菌基本信息 中文名:小麦印度腥黑穗病菌。 学名:TilletiaindicaMitra。 异名:Neovossiaindica(Mitra)Mundkur。 病害英文名:karnalbuntofwheat(简称KB),partialbuntofwheat。 属真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、黑粉菌纲Ustomycetes、黑粉菌目Ustilaginales、腥黑粉 菌科Tilletiaceae、腥黑粉菌属Tilletia。 小麦印度腥黑穗病菌主要通过发病种子和附着于健康种子表面的冬孢子进行远距离传播,也可随 土壤及其他农用工具进行传播。 小麦印度腥黑穗病菌的其他信息参见附录A。 4　方法原理 根据小麦印度腥黑穗病菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征,应用相关仪器,包括显微镜 和PCR仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定。 5　检疫鉴定流程 检疫鉴定流程见图1。 1GB/T28080—2011 图1　小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程图 2GB/T28080—2011 6　取样方法 6.1　未经加工小麦取样方法 按照GB/T18085取样方法进行取样。 6.2　加工小麦取样方法 实施堆垛抽样时,在堆垛四周按正弦曲线从上、中、下层随机确定抽样点。 实施船舱内货物抽样时,以50m2为一个抽样区,每区设中心及四角(距边缘1m处)五个抽样点, 每增加一个抽样区,增加三个抽样点。集装箱或车厢装载的麦麸、面粉抽样参照船舱抽样方法进行。 6.3　袋装面粉抽样比例 10袋以下,逐袋抽样。 10~100袋,随机取10件。 100袋以上,按一批货物总袋数的平方根数抽取见式(1)。 n=N …………………………(1) 　　式中: N———一批货物的总袋数; n———应抽取件数(n值取整数,小数部分向上修约)。 7　主要仪器设备和试剂 7.1　主要仪器设备 7.1.1　摇床。 7.1.2　显微镜。 7.1.3　纯水器。 7.1.4　测序仪。 7.1.5　电泳仪。 7.1.6　低温冰箱。 7.1.7　显微操作仪。 7.1.8　超净工作台。 7.1.9　高压灭菌锅。 7.1.10　光照培养箱。 7.1.11　旋涡振荡器。 7.1.12　普通离心机。 7.1.13　冷冻干燥机。 7.1.14　凝胶成像仪。 7.1.15　核酸蛋白分析仪。 7.1.16　PCR仪(常规PCR仪、实时荧光PCR仪)。 7.1.17　破壁针(具有平截切面的针,能将孢子压碎)。 7.1.18　培养皿(9cm)。 3GB/T28080—2011 7.1.19　筛网(53μm、20μm)。 7.1.20　孔径100μm的毛细管。 7.1.21　锥形瓶(250mL、500mL)。 7.1.22　盖玻片(18mm×18mm)。 7.1.23　PCR反应管(0.2mL,0.5mL)。 7.1.24　载玻片(25mm×76mm,厚(0.8mm~1.0mm)。 7.1.25　Tip头(0.1μL~10μL,5μL~200μL,100μL~1000μL)。 7.1.26　可调微量移液器(2μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL)。 7.2　主要试剂 7.2.1　三氯甲烷。 7.2.2　异戊醇。 7.2.3　异丙醇。 7.2.4　醋酸钠。 7.2.5　甲酰胺。 7.2.6　70%乙醇。 7.2.7　无水乙醇。 7.2.8　Tris饱和酚。 7.2.9　Taq酶。 7.2.10　Gelatin。 7.2.11　溴化乙锭。 7.2.12　DNAMarker。 7.2.13　PDA培养基。 7.2.14　水琼脂培养基。 7.2.15　SDS提取液。 7.2.16　PCR缓冲液。 7.2.17　电泳缓冲液。 7.2.18　上样缓冲液。 7.2.19　Bigdye试剂盒。 7.2.20　TaqManUniversalPCRMasterMix。 7.2.21　席尔氏浮载剂,见GB/T18085。 7.2.22　dNTPs(dATP、