ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28083—2011 栎 枯萎病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofCeratocystisfagacearum(Bretz)Hunt 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:严进、吴品珊、陈克、黄英、陈岩、段胜男、常雪艳。 ⅠGB/T28083—2011 栎枯萎病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了栎枯萎病菌的检疫鉴定方法,包括对栎属(QuercusL.)和栎枯萎病菌其他寄主的原 木、木制品、木质包装和苗木的检疫。 本标准适用于对来自栎枯萎病发生国家和地区的所有栎属植物和栎枯萎病菌其他寄主的检疫 鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 栎枯萎病菌基本信息 壳斗长喙壳[Ceratocystisfagacearum(Bretz)Hunt]属真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota), 核菌纲(Pyrenomycetes),球壳目(Sphaeriales),长喙壳科(Ophiostomataceae),长喙壳属(Ceratocystis Ell.&Halst.)。 栎枯萎病菌其他信息参见附录A。 4 方法原理 栎枯萎病菌的寄主范围、传播途径、植株症状(参见图B.4)和病原形态(参见图B.1、图B.2、图B.3)是 栎枯萎病菌检疫鉴定方法的依据。 5 试剂与标准菌株 5.1 试剂 葡萄糖(C6H6O6·H2O)、甲(苯)丙氨酸、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、硫酸 铁[Fe2(SO4)3·xH2O含量(以Fe计)21.0~23.0%]、硫酸锰(MnSO4)、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、维 生素H(VitaminH)、琼脂粉。 以上试剂除特殊注明外,均为化学纯。 5.2 标准菌株1) 1) 来自美国的Ceratocystisfagacearum(Bretz)HuntA1和A2标准菌株保存于中国检验检疫科学研究院动植物 检疫研究所。 Ceratocystisfagacearum(Bretz)HuntA1和A2标准菌株。 1GB/T28083—2011 6 主要仪器设备 6.1 仪器设备 立体显微镜、生物显微镜(具油镜和测微尺)、电子分析天平(感量0.001g)、普通天平(感量0.1g)、 超净工作台、生物培养箱、高压灭菌器。 6.2 试验用具 斧子、锯子、手持放大镜、培养皿、三角瓶(500mL)、试管(直径12mm)、烧杯(1000mL)、手术刀、 手术剪、镊子、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯。 7 检疫与鉴定 7.1 现场检疫 7.1.1 样品抽取 按照SN/T2122规定的方法。 7.1.2 现场检疫 将抽取的原木或木制品或苗木用斧子或锯子分别横向和纵向切开,仔细观察横断面和纵断面有无 黑褐色条纹。如带皮,则要检查树皮和木质部之间是否有垫状菌丝层和边材上是否有传病媒介(参见附 录C)。 将有症状样品带回实验室作进一步检验。 7.2 室内检测与鉴定 7.2.1 分离培养 采用麦芽浸出液酵母培养基或NFP培养基(见附录D),用于病原菌的分离、培养形状测定和菌种 保存。 在可疑发病的褐色条纹处取一块组织,切成4mm×4mm的小片,用0.5%NaOCl表面消毒 5min,无菌水冲洗3遍,放在直径9cm的平板培养基上,每皿放4片~6片,于24℃培养箱内培养,黑 暗和光照各12h交替。7d后用显微镜检查。 若发现昆虫,首先需进行形态鉴定(参见附录C),如为露尾甲,则应检查是否携带栎枯萎病菌,方法 是将其肢解,组织片用上述方法分离培养。 7.2.2 形态观察 观察并记录培养基上生长菌落的形态特征。 从菌落中挑取少量培养物,以水作浮载剂,制成玻片,在显微镜下观察。如为Ceratocystis fagacearum的无性阶段,即可观察到分生孢子梗和分生孢子。详细记载分生孢子和菌丝的形态,记录 并测量分生孢子梗、分生孢子大小。 用直径4mm的打孔器取菌落边缘的菌块2块,分别放在2个NFP培养基平板的一侧;用同法分 别取标准菌株CeratocystisfagacearumA1和A2交配型的菌块各1块,分别放在上述平板培养基的另 一侧,于24℃下培养7d~10d。用立体显微镜观察同一平板培养基上的两菌落交界处是否产生子囊 2GB/T28083—2011 壳。挑取两菌落交界处产生的子囊壳制成玻片,于显微镜下观察。 如与A1交配型菌落交界处产生子囊壳,则待测菌株为A2交配型,如与A2交配型菌落交界处产 生子囊壳,则待测菌株为A1交配型。 记载子囊壳、子囊和子囊孢子的形态特征并测量和记录子囊壳、子囊和子囊孢子大小。 8 鉴定标准 8.1 营养体形态 菌落呈绒毛状,厚1mm~3mm,初为白色,后为淡灰色至黄绿色,常有褐色斑块。 菌丝分枝有横隔,淡色至褐色,宽2.5μm~6.0μm,菌落中还能形成菌核,菌核茶褐色至黑色,质 地疏松,形状不定,直径可达2.5cm。此外,还可形成一种橄榄色厚垣孢子。 8.2 无性繁殖器官形态 分生孢子内生,无色,单胞,圆筒形,两端平截,大小为(2μm~4.5μm)×(4μm~22μm),在培养 基上可形成分生孢子链。分生孢子梗分枝或不分枝,宽2.5μm~5μm,长20μm~60μm,淡色至黑 色,有分隔,顶端逐渐变尖(参见图B.1)。 8.3 有性繁殖器官形态 子囊壳单生或丛生,黑色,瓶形,基部球形,直径240μm~380μm,几乎整个埋于基质内。子囊壳 具有长喙,喙长250μm~450μm,顶端生有无色须状物(参见图B.2)。子囊球形至近球形,最大直 径7μm~10μm,内含8个子囊孢子。子囊孢子单胞,无色,椭圆形,微弯,大小为(2μm~3μm)× (5μm~10μm)(参见图B.3)。子囊壁易消解,成熟后,子囊孢子从孔口流出,聚集在白色粘液中呈小 滴状,在水中不易分散。 9 结果判定 如形态鉴定结果与8.1、8.2、8.3相符合,即可确定分离物为Ceratocystisfagacearum(Bretz) Hunt。 10 样品保存 10.1 菌种保存 分离获得的Ceratocystisfagacearum菌种,应转入试管斜面,置于15℃黑暗条件下保存至少12个 月,以备复验、谈判和仲裁。 10.2 传病介体保存 捕获的传病昆虫除用于分离病原菌外,其余的应使其存活至检验鉴定完成,然后制成标本。尽量保 持其身体各部位的完整性。 3GB/T28083—2011 附 录 A (资料性附录) 栎枯萎病菌Ceratocystisfagacearum(Bretz)Hunt分布和寄主 A.1 分布 欧洲:保加利亚、波兰、罗马尼亚。 北美洲:美国(阿肯色、印地安纳、伊利诺斯、依阿华、堪萨斯、肯塔基、马里兰、密执安、明尼苏达、密 苏里、内布拉斯加、北卡罗莱纳、南卡罗莱纳、南达科他、俄亥俄、俄克拉荷马、宾夕法尼亚、田纳西、得克 萨斯、弗吉尼亚、西弗吉尼亚、威斯康星)。 A.2 寄主 栎属QuercusL.、栗属CastaneaMill.、锥属CastanopsisSpach和石栎属LithocarpusBl.的全 部种。 4GB/T28083—2011 附 录 B (资料性附录) 病原菌形态示意图和症状 图B.1 分生孢子和分生孢子梗 图B.2 子囊壳 图B.3 子囊孢子 图B.4 栎树边材上黑褐色条斑 5GB/T28083—2011 附 录 C (资料性附录) 栎枯萎病菌Ceratocystisfagacearum(Bretz)Hunt传病媒介 C.1 传病媒介 果实露尾甲属 CarpophilusStephens C.lugubris 露尾甲属 GlischrochilusReiffer G.sanguinolentus G.quadrisignatus G.fasciatus G.siepmanni 鬃额小蠹属 PseudopityophthorusSwaine P.minutissimus P.pruinosis 毛束小蠹 ScolytusintricatusRatzeburg C.2 露尾甲科形态描述 体长1mm~7mm;体宽扁,黑色或褐色;头显露,上颚宽,强烈弯曲;触角短,11节,柄节及端部 3节膨大,中间各节较细;前胸背板宽大与长;鞘翅宽大,表面有纤毛和刻点行,臀板外露或末端2节~ 3节背板外露;前、中足基节横形,基前转片明显;胫节短部膨大,前足胫节外侧具锯齿突起,跗节5-5-5, 第3节双叶状,第4节很小,第5节较长;腹部可见5节。 幼虫圆形,头小;下颚关节区退化;下唇须1节;触角3节;复眼3对~4对,第9腹节末端具尖的 尾突。 C.3 小蠹科形态描述 微小至小形,体长1mm~9mm,宽短,圆筒形。头部的一部分向下方延长成较短的头管,象鼻部 分短而不甚明显。触角短,锤状,呈膝状弯曲,末端3节膨大。前胸背板大,长度约占体长的三分之一以 上,前端收狭。外咽片消失,仅存1条外咽缝;无上唇;下颚须3节,节间僵直不能活动;足胫节有齿,跗 节5节,其