ICS65.020.30 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T28630.1—2012 白 斑综合征(WSD)诊断规程 第1部分:核酸探针斑点杂交检测法 Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease— Part1:DotblothybridizationmethodwithDNAprobe 2012-07-31发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 GB/T28630《白斑综合征(WSD)诊断规程》分为五个部分: ———第1部分:核酸探针斑点杂交检测法; ———第2部分:套式PCR检测法; ———第3部分:原位杂交检测法; ———第4部分:组织病理学诊断法; ———第5部分:新鲜组织的T-E染色法。 本部分为GB/T28630的第1部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本部分起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。 本部分主要起草人:黄倢、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦、刘莉。 ⅠGB/T28630.1—2012 引 言 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,涉及到国家发明专利“对虾流行病病原检测试剂 盒及其检测方法”(ZL00111336.4)的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他们愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件 下,就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过 以下联系方式获得: 专利持有人姓名:史成银、杨冰、黄倢、宋晓玲、杨丛海。 地址:中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东省青岛市南京路106号。 请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 ⅡGB/T28630.1—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第1部分:核酸探针斑点杂交检测法 1 范围 GB/T28630的本部分规定了白斑综合征核酸探针斑点杂交检测方法所需试剂与材料、仪器设备、 操作步骤和结果判定。 本部分适用于对虾的成虾、幼虾、仔虾、幼体和受精卵的活体、冰鲜或冰冻产品和其他对白斑综合征 病毒敏感的甲壳类生物白斑综合征病原的筛查、临床病症的确诊,不适用于对病毒感染活性的估测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件。 GB/T28630.4—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第4部分:组织病理学诊断法 3 原理 3.1 白斑综合征的病原和病理学特征 见GB/T28630.4—2012的2.1。 3.2 技术原理 以非放射性标记物———地高辛标记的白斑综合征病毒(WSSV)DNA片段,即核酸探针,与存在于 样品中的病毒DNA进行特异性的核酸分子杂交,通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应显示样 品中病毒的存在。 4 试剂和材料 4.1 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 4.2 含氯消毒剂:医用品或水产药物。 4.3 杂交膜:硝酸纤维素膜。 4.4 PCRDIGProbeSynthesisKit1)。 4.5 十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl):生化试剂。 4.6 十二烷基硫酸钠(SDS):生化试剂。 4.7 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·2H2O):生化试剂。 4.8 巯基乙醇:生化试剂。 4.9 Tris平衡酚(饱和酚):生化试剂。 1) PCRDIGProbeSynthesisKit是由Roche公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本部分的使用 者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。 1GB/T28630.1—2012 4.10 封闭剂:BlockingReagent2),生化试剂。 4.11 碱性磷酸酶偶联的DIG抗体(AP-抗DIG,0.75U/μL,4℃):生化试剂。 4.12 琼脂糖:电泳级。 4.13 1kbDNAMarker:生化试剂。 4.14 TaqDNA聚合酶(5U/μL):生化试剂,-20℃保存。 4.15 10×PCR缓冲液:生化试剂,无Mg2+,随TaqDNA聚合酶提供,-20℃保存。 4.16 氯化镁溶液(25mmol/L):生化试剂,-20℃保存。 4.17 dNTP:生化试剂,含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/L的混合物,-20℃保存。 4.18 核酸探针引物序列F:5′-CTGTAATTGGACGAGGAG-3′。 4.19 核酸探针引物序列R:5′-CTGCCAACCTTAGAGTTC-3′。 4.20 研磨液:见附录A的规定。 4.21 泡膜液:见附录A的规定。 4.22 预杂交母液:见附录A的规定。 4.23 1×缓冲液A:见附录A的规定。 4.24 1×缓冲液B:见附录A的规定。 4.25 1×清洗液Ⅰ:见附录A的规定。 4.26 1×清洗液Ⅱ:见附录A的规定。 4.27 显色剂A:见附录A的规定。 4.28 显色剂B:见附录A的规定。 4.29 溶有显色剂A和显色剂B的1×缓冲液B:见附录A的规定。 4.30 扁头镊子。 4.31 剪刀。 4.32 洗涤皿:直径5cm~9cm的平皿。 4.33 吸管。 4.34 玻璃研磨棒或塑料研磨棒。 4.35 杂交袋。 4.36 暗盒:不透光的容器,可用任何能避免强光直射的盒子或袋子代替。 4.37 1.5mL塑料微量离心管:经高压蒸汽灭菌。 4.38 一次性塑料手套。 4.39 滤纸。 5 仪器设备 5.1 普通冰箱:具冷藏箱,并带-18℃以下冷冻箱体。 5.2 台式高速离心机:用于1.5mL塑料微量离心管的离心,最高转速可达12000r/min以上。 5.3 恒温箱:可满足80℃±5℃。 5.4 水浴锅:可满足65℃±1℃。 5.5 振荡器:振荡频率40r/min~220r/min。 5.6 塑料封口机:可满足5cm以上杂交袋热塑封口,溶液溢出到电阻丝或外壳上时不会发生漏电。 5.7 电炉或其他加热设备:可满足200mL~2000mL水在敞口容器中沸腾10min。 2) BlockingReagentⅡ是由Roche公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本部分的使用者,并不表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。 2GB/T28630.1—2012 5.8 微量移液器:量程0.5μL~10μL。 5.9 温度计:量程0℃~100℃,精度±1℃。 6 操作步骤 6.1 样品的准备 6.1.1 样品采集的要求见GB/T28630.4—2012中附录B的规定。 6.1.2 取对虾的个体(适用于3cm以下幼虾、仔虾,幼体和受精卵)或对虾的胃或鳃丝组织(适用于活 体或冰冻的养成期幼虾、成虾和亲虾)样品约0.1g,置于1.5mL灭菌塑料微型离心管中,加入0.3mL 研磨液,用研磨棒将样品充分研磨后,于8000r/min~10000r/min离心2min取上清备用。 6.1.3 为防止交叉污染,接触样品的工具及研磨棒要浸于新配制的有效氯含量3.0×10-3含氯消毒剂 中5min,再充分清洗后方可用于下一个样品。 6.2 核酸探针的制备 6.2.1 模板为纯化病毒核酸。标记之前需优化并确定PCR反应条件。100μL反应体系:10μL10× PCR缓冲液、1μL10mmol/LdTTP、2μLdNTP、8μL25mmol/LMgCl2、5μL引物F(10ng/μL)、 5μL引物R(10ng/μL)、2μL模板、灭菌双蒸水66μL;混匀后,进行一个热启动(94℃10min、55℃ 5min);离心后加入1μLTaqDNA聚合酶(5U/μL),进行35个循环(92℃30s、52℃30s、72℃ 1min),72℃5min后4℃保存。PCR产物大小:546bp。 6.2.2 核酸探针标记方法按照4.4的说明进行。 6.3 泡膜 按样品数量隔着衬纸在杂交膜上用软铅笔划格,每样为5mm×5mm小格,同时要加上阴性对照 和阳性对照的数目,沿框线将所需大小的杂交膜剪下,共需两张。左上角剪角的一张为测试膜,左上角 用软铅笔点点标记的为对照膜。将杂交膜飘浮于蒸馏水表面,吸水后沉入水中10min,后浸泡于泡膜 液中5min,再将膜置于滤纸上晾干。 6.4 点样 将准备好的样品上清液(包括阴性对照和阳性对照)在100℃水浴中煮沸10min,再迅速置于冰水 浴中2min以上。稍离心使管内水珠集中,在晾干的测试膜和对照膜相应方格内点样,每样1μL,自然 晾干。 6.5 交联 将晾干的杂交膜夹于两张滤纸中间,放于80℃烘箱中烘烤2h。 6.6 预杂交 按杂交膜大小准备适量的预杂交母液(0.2mL/cm2)并加入封闭剂(每毫升预杂交母液加入10mg 封闭剂),在65℃不断搅动溶解。 将两张膜分别置于两个杂交袋中,加入溶有封闭剂的预杂交母液,封口,在65℃水浴中孵育2h。 6.7 杂交 按膜大小计算所需探针含量:每毫升溶有封闭剂的预杂交母液中加入1μL~4μL标记核酸探针。 3GB/T28630.1—2012 将探针于100℃水浴中煮沸10min,再迅速置于冰水浴中,2