ICS65.020.30 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T28630.4—2012 白 斑综合征(WSD)诊断规程 第4部分:组织病理学诊断法 Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease— Part4:Histopathologymethod 2012-07-31发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 GB/T28630《白斑综合征(WSD)诊断规程》分为五个部分: ———第1部分:核酸探针斑点杂交检测法; ———第2部分:套式PCR检测法; ———第3部分:原位杂交检测法; ———第4部分:组织病理学诊断法; ———第5部分:新鲜组织的T-E染色法。 本部分为GB/T28630的第4部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本部分起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。 本部分主要起草人:黄倢、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦、刘莉。 ⅠGB/T28630.4—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第4部分:组织病理学诊断法 1 范围 GB/T28630的本部分规定了白斑综合征组织病理学诊断法所需试剂与材料、仪器设备、操作步骤 和结果判定。 本部分适用于对发病的对虾或其他敏感宿主的确诊和对怀疑染病宿主的诊断。 本部分不适用于对潜伏性感染或病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测。 2 原理 2.1 白斑综合征的病原和病理学特征 白斑综合征(whitespotsyndrome)又称白斑病(whitespotdisease)、白斑综合症、对虾暴发性流行 病。白斑综合征具有发病急和死亡率高的特征,其症状是发病对虾停止摄食,反应迟钝,或卧于池边或 在水面浮游,某些濒死对虾在甲壳上出现白色的斑块,有时伴随对虾腹节微微变红。 白斑综合征的病原是白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)或称白斑病毒(white spotvirus,WSV),它是一种双链DNA(dsDNA)病毒,能对大多数养殖对虾造成有致命的感染。病毒 粒子为长椭圆形,具有囊膜和独特的尾状物,直径120nm~150nm,长270nm~290nm,其基因组大小 约300kb。病毒在细胞核内复制,不形成封闭体(occlusionbody)。 濒死虾在全身外胚层和中胚层起源的组织中呈现出病灶,病毒主要感染的组织包括甲壳下上皮(包 括体表和附肢的甲壳下表皮、胃上皮和后肠上皮)、造血组织、鳃、结缔组织、触角腺、血细胞和淋巴器官 等。感染早期在核内形成的包涵体(inclusion)呈嗜酸性,随着病毒的快速复制,造成核内染色质边移, 细胞核肥大,包涵体的嗜碱性也越来越强。 2.2 技术原理 苏木精-伊红(H-E)染色在组织学和病理学中是一种常规染色方法。通过染色液———苏木精-伊红 与组织细胞的不同组分分别相结合,使细胞核、细胞质和细胞内其他结构产生反差明显的蓝紫色和红 色,而可清晰地观察到各种不同的组织结构病理变化。 3 试剂和材料 3.1 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 3.2 石蜡(熔点52℃~54℃):切片级。 3.3 二甲苯。 3.4 无水乙醇。 3.5 95%乙醇。 3.6 过滤海水:盐度为20~30的海水在室内放置1周后,经滤纸和0.22μm滤膜过滤。 3.7 戴维森氏AFA(Davidson’sAFA)固定液:见附录A的规定。 1GB/T28630.4—2012 3.8 迈尔-班尼特苏木精(Mayer-BennettHematoxylin)染色液:见附录A的规定。 3.9 伊红-焰红染色液:见附录A的规定。 3.10 粘片剂:见附录A的规定。 3.11 85%乙醇:见附录A的规定。 3.12 80%乙醇:见附录A的规定。 3.13 75%乙醇:见附录A的规定。 3.14 50%乙醇:见附录A的规定。 3.15 阳性对照为受WSSV感染且显示明显病理变化的对虾组织切片(苏木精-伊红染色)。 3.16 阴性对照为未受WSSV感染的正常的对虾组织切片(苏木精-伊红染色)。 4 仪器设备 4.1 石蜡切片机:满足4μm~7μm厚度的石蜡连续切片要求。 4.2 程控组织脱水机或使用手工脱水步骤。 4.3 石蜡包埋机或使用手工包埋步骤:满足石蜡切片机对石蜡块规格的要求。 4.4 程控切片染色机或使用手工染色步骤。 4.5 展片水浴锅:敞口,无盖水浴锅或使用自制保温盒加一定温度的水代替。 4.6 平板烘片机:室温至100℃或使用恒温箱代替。 4.7 显微镜:带高倍镜(40×)和油镜(100×)。 4.8 毛笔。 4.9 小镊子。 4.10 载玻片。 4.11 盖玻片。 4.12 玻片架。 5 操作步骤 5.1 样品准备 5.1.1 样品采集的要求和固定方法见附录B的规定。 5.1.2 在制作切片前,按照附录B的方法进行取材修整,应保证标本的胃和鳃能被有效地切片。 5.2 脱水 75%乙醇(105min→)85%乙醇(105min→)85%乙醇(105min)→95%乙醇(45min)→95%乙醇 (45min)→无水乙醇(45min)→无水乙醇(45min)。 5.3 透明 无水乙醇-二甲苯(1∶1,25min)→二甲苯(20min)→二甲苯(20min)。 5.4 浸蜡 纯石蜡(80min)→纯石蜡(80min)。 5.5 包埋 用石蜡包埋机进行包埋。 2GB/T28630.4—2012 5.6 切片 用石蜡切片机切片,厚度5μm。对每个石蜡包埋块至少切取两块不连续的切片。 5.7 展片 展片水浴锅(40℃)中展片,用涂有一层粘片剂的载玻片捞出,置于平板烘片机上于45℃烘片2h。 5.8 染色 二甲苯(5min)→二甲苯(5min)→无水乙醇(2min)→无水乙醇(2min)→95%乙醇(2min)→ 95%乙醇(2min)→80%乙醇(2min)→80%乙醇(2min)→50%乙醇(2min)→蒸馏水(2min)→蒸馏 水(2min)→蒸馏水(2min)→迈尔-班尼特苏木精染色液(5min)→缓慢流动的自来水(6min)→伊红- 焰红染色液(2min)→95%乙醇(80s)→95%乙醇(2min)→无水乙醇(2min)→无水乙醇(2min)→二 甲苯(150s)→二甲苯(150s)→二甲苯(150s)。 5.9 封片 滴加2滴中性树胶封片。 5.10 观察 明视野显微镜下观察。 6 结果判定 6.1 正常样品的组织切片经H-E染色后,核质反差明显,细胞质染成红色,细胞核染成蓝紫色。 6.2 白斑综合征的病灶主要出现在对虾的甲壳下上皮(包括体表和附肢的甲壳下表皮、胃上皮和后肠 上皮)、造血组织、结缔组织、鳃、触角腺、血细胞、淋巴器官等组织中,最方便观察的组织是覆盖有甲壳质 的胃上皮。在肝胰腺管上皮、中肠上皮和肌肉细胞中无感染病灶,但在这些组织中的结缔组织和血细胞 中可见到病灶。 6.3 受感染的细胞,其细胞核的核仁消失,早期感染在核内出现嗜酸性着色(显红色),晚期感染的细胞 核肿大,染色质边移,核内呈不同程度地较均匀的嗜碱性着色(紫色)。核内嗜酸性着色(显红色),较深 且均一。 6.4 诊断结果可疑时,补充核酸探针的原位杂交检测或PCR检测进行确诊。 3GB/T28630.4—2012 附 录 A (规范性附录) 试剂配方 A.1 85%乙醇 95%乙醇 850mL 加水定容至 950mL 混匀,室温贮存。 A.2 80%乙醇 95%乙醇 800mL 加水定容至 950mL 混匀,室温贮存。 A.3 75%乙醇 95%乙醇 750mL 加水定容至 950mL 混匀,室温贮存。 A.4 70%乙醇 95%乙醇 700mL 加水定容至 950mL 混匀,室温贮存。 A.5 50%乙醇 95%乙醇 500mL 加水定容至 950mL 混匀,室温贮存。 A.6 戴维森氏AFA(Davidson’sAFA)固定液 95%乙醇 330mL 甲醛(37%) 220mL 冰乙酸 115mL 海水(用于海洋甲壳类)或自来水335mL 混匀,室温密封贮存。 4GB/T28630.4—2012 A.7 R-F固定液 95%乙醇 407mL 甲醛(37%) 349mL 海水(用于海洋甲壳类)或自来水222mL 混匀,加入氨水(含28%~30%NH3)约22mL,将pH调整到6.0~7.0。 室温密封贮存。 A.8 迈尔-班尼特苏木精染色液 热水 1000mL 苏木素 1.0g 碘酸钠 0.2g 钾明矾 90.0g 柠檬酸 1.0g 水合三氯乙醛 50.0g 按上述顺序混合,溶解后即可使用,室温贮存。 A.9 1%伊红贮存液 伊红Y(水溶性) 5g 水 500mL 溶解后置于棕色瓶中,室温贮存。 A.10 1%焰红贮存液 焰红B(水溶性) 1g 水 100mL 溶解后置于棕色瓶中,室温贮存。 A.11 伊红-焰红染色液 1%伊红贮存液 100mL 1%焰红贮存液 10mL 95%乙醇 780mL 冰乙酸 4mL 混匀后即可使用,室温贮存。 A.12 粘片剂 明胶 1g 热水 100mL 5GB/T28630.4—2012 溶解后,加入: 苯酚 2g 甘油 15mL 混匀,在棕色瓶中室温贮存。 6GB/T28630.4—2012