ICS65.120 B46 中华人民共和国国家标准 GB/T28642—2012 饲 料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应(PCR)法 RapiddeterminationofSalmonellaspp.inanimalfeedingstuffs— PCRmethod 2012-07-31发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。 本标准起草单位:农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心(沈阳)。 本标准主要起草人:张秀芹、张建勋、杜柏林、李欣南、杨希国、马俊驰、陈晓月。 ⅠGB/T28642—2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应(PCR)法 1 范围 本标准规定了饲料中沙门氏菌的快速检测的PCR方法。 本标准适用于饲料中沙门氏菌的定性筛选。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T13091 饲料中沙门氏菌的检测方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 SN/T1870 食品中致病菌检测方法 实时PCR法 3 原理 利用沸水浴使菌体细胞破裂,释放基因组DNA,离心使细胞壁等有形物沉淀,以上清液为模板进行 扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。 4 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,试验用水符合GB/T6682的要求。 4.1 沙门氏菌检测用引物(对)序列为: SalF:5′-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC-3′ SalR:5′-GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT-3′ 4.2 PremixTaq缓冲液(2×):内含TaqDNA聚合酶1.25U/25μL,4mmolMg2+,dNTP 各0.4mmol。 4.3 琼脂糖:电泳级。 4.4 Marker2000。 4.5 缓冲蛋白胨水(BPW):见A.1。 4.6 大豆蛋白胨肉汤(RVS):见A.2。 4.7 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC):见A.3。 4.8 10倍上样缓冲液(10×loadingbuffer):0.05%的溴酚蓝,50%丙三醇溶液,1%的SDS。 4.9 质控菌株:沙门氏菌阳性标准菌株。 4.10 50×TAE缓冲液:见A.4。 1GB/T28642—2012 4.11 1×TAE缓冲液:见A.5。 4.12 溴化乙锭(5mg/mL):见A.6。 注:4.2和4.8缓冲液为商品化成品。以上用于PCR反应及电泳试验的试剂可用功能相当的其他产品替代。 5 仪器设备 5.1 PCR仪。 5.2 恒温水浴锅。 5.3 离心机:离心转速12000g。 5.4 微量移液器。 5.5 电泳仪。 5.6 凝胶成像仪。 5.7 天平:感量0.01g。 5.8 电热恒温培养箱。 6 试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样,将实验室样品充分混匀后密封低温保存待用,注意整个过程中不要将样 品人为污染。 7 检验步骤 7.1 样品的增菌及模板的制备 取25g样品于225mL的缓冲蛋白胨水(BPW,4.5)中,37℃±1℃培养18h±2h进行预增菌,取 0.1mL预增菌液转移至10mL大豆蛋白胨肉汤(RVS,4.6)培养基内,41.5℃±1℃培养24h±3h。 同时取10mL预增菌液于100mL 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC,4.7)中37℃±1℃培养24h±3h,进 行选择性增菌,取选择性增菌液1mL于离心管中10000g离心10min,弃上清,1mL无菌去离子水悬 浮离心10min,弃上清,再用0.2mL无菌去离子水悬浮,95℃水浴20min,将离心管迅速转移至冰浴 中使其迅速冷却,用涡旋仪混匀裂解物,20℃~25℃下10000g离心3min,转移上清至新鲜管中备用 (模板制备可选用商业试剂盒)。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照,用添加沙门氏菌阳性标准菌 株的样品作阳性对照,用不含沙门氏菌的样品作阴性对照。 7.2 PCR扩增 50μL的反应体系,在0.2mL的反应管中,PremixTaq缓冲液(4.2)25μL,模板4μL,浓度为 20μmol/L的上下游引物各1μL,去离子水19μL。 反应程序为:94℃预变性2min,30个循环:94℃变性1min,58.4℃退火40s,72℃延伸30s; 72℃终延伸7min后4℃保存。 7.3 电泳检测PCR扩增产物 取1.5g琼脂糖(4.3),于100mL 1×TAE缓冲液(4.11)中加热,充分熔化,冷至65℃左右的时 候,加入10μL溴化乙锭(4.12),充分混匀,根据需要在模板内放入合适的梳子,制成约5mm厚的胶 块。在电泳槽中加入1×TAE缓冲液,使液面没过凝胶2mm~3mm。将6μL~8μL的PCR扩增产 物与1μL10倍上样缓冲液(4.8)混合后点样,取6μLMarker2000(4.4)点样。5V/cm~8V/cm恒 压电泳,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部,用成像仪进行凝胶成像。 2GB/T28642—2012 8 结果表述 在阴性对照于330bp处未出现条带,而阳性对照在330bp处出现扩增条带的条件下,如待测样品 在330bp处未出现相应大小的扩增条带,则可报告待测样品未检出沙门氏菌;如待测样品在相应处出 现扩增条带,则为疑似阳性样品,此时需用GB/T13091进行确证,最终结果以后者检测结果为准。对 于疑似阳性样品,可以对其扩增产物进行测序,结果参照附录B。 如果阴性对照出现条带和(或)阳性对照未出现预期大小的扩增条带,本次待测样品的结果无效,应 重新进行检测,并排除污染因素。 9 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193、SN/T1870和GB19489的要求执行。 10 废弃物处理 检测过程中的废弃物及一切可能被污染的物品均应做无害化处理。 3GB/T28642—2012 附 录 A (规范性附录) 培养基及缓冲液的配制 A.1 缓冲蛋白胨水(BPW) A.1.1 成分 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 磷酸氢二钠 9.0g 磷酸二氢钾 1.5g 蒸馏水 1000mL pH7.0 A.1.2 制法 按上述成分分配好,校正pH,分装于大瓶中,121℃高压灭菌20min,临用时分装在500mL无菌 瓶中,每瓶225mL,或配好后校正pH,分装于500mL瓶中,每瓶225mL,121℃高压灭菌20min,冷 却备用。 A.2 大豆蛋白胨肉汤(RVS) A.2.1 溶液A A.2.1.1 成分 蛋白胨 5.0g 氯化钠 8.0g 磷酸二氢钾 1.4g 磷酸氢二钾 0.2g 蒸馏水 1000mL pH7.0 A.2.1.2 制法 将各成分加入蒸馏水中,加热至约70℃溶解。此溶液需当天使用。 A.2.2 溶液B A.2.2.1 成分 氯化镁 400.0g 蒸馏水 1000mL A.2.2.2 制法 将氯化镁溶于水中。 4GB/T28642—2012 A.2.3 溶液C A.2.3.1 成分 孔雀绿 0.4g 蒸馏水 100mL A.2.3.2 制法 将孔雀绿溶于水中。溶液可室温保存于棕色玻璃瓶中。 A.2.4 完全培养基 A.2.4.1 成分 溶液A 1000mL 溶液B 100mL 溶液C 10mL A.2.4.2 制法 按上述比例配制,校正pH,使灭菌后pH为5.2,分装于试管中,每管10mL。115℃高压灭菌 15min。 冰箱保存。 A.3 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC) A.3.1 基础液 A.3.1.1 成分 胰蛋白胨 5.0g 乳糖 4.0g 磷酸氢二钠 10.0g 亚硒酸钠 4.0g 蒸馏水 1000mL pH7.0 A.3.1.2 制法 溶解前三种成分于水中,煮沸5min,冷却后,加入亚硒酸钠,校正pH后分装,每瓶1000mL。 A.3.2 L-胱氨酸溶液 A.3.2.1 成分 L-胱氨酸 0.1g 1mol/L氢氧化钠溶液 15mL A.3.2.2 制法 在无菌环境中,用灭菌水将上述成分稀释到100mL,毋须蒸汽灭菌。 5GB/T28642—2012 A.3.3 完全培养基制备 基础液 1000mL L-胱氨酸溶液 10mL pH7.0 基础液冷却后,以无菌操作加L-胱氨酸溶液,将培养基分装于适当容量的灭菌瓶中,每瓶100mL。 注:培养基在配制当日使用。 A.4 50×TAE缓冲液 A.4.1 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 取二水乙二胺四乙酸二钠186.1g,加入800mL蒸馏水充分搅拌,加10mol/L的氢氧化钠调解 pH至8.0,待完全溶解后,定容至1L。高压灭菌。 A.4.2 制法 Tris碱242.0g溶于700mL的水中,加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL,冰乙酸57.1mL, 充分溶解,用水定容至1L。 A.5 1×TAE缓冲液 取20mL50×TAE,加水定容至1000mL。Tris-乙酸终浓度为0.04mol/L,EDTA终浓度 为0.001mol/L。 A.6 溴化乙锭(5mg/mL) 取溴化乙锭0.0500g溶于10mL水中。 6GB/T28642—2012