ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28974—2012 马 铃薯A病毒检疫鉴定方法 纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 DetectionandidentificationofpotatovirusA—Nanoparticles-enlargedincolloidal goldimmunochromatographicassay 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:邹明强、张帆、李锦丰、陈艳、戴华、田世民、马吉湘、金涌。 ⅠGB/T28974—2012 引 言 本文件的发布机构提请注意,申明符合本文件时,可能涉及到6.4.3、B.4与增敏试剂相关的专利 的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下, 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得: 该专利持有人:中国检验检疫科学研究院 联系人:邹明强 地址:北京市朝阳区高碑店北路甲3号 中国检验检疫科学研究院 邮编:100123 请注意除上述专利外,本文件的某些内容能够仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这 些专利的责任。 ⅡGB/T28974—2012 马铃薯A病毒检疫鉴定方法 纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 1 范围 本标准规定了用纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法检测马铃薯A病毒的原理、实验步骤及结果判 定等。 本标准适用于植物及其产品组织中马铃薯A病毒的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T23629—2009 引进植物病原生物安全控制技术要求 GB/T23632—2009 进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程 3 马铃薯A病毒基本信息 中文名:马铃薯A病毒 学名:potatovirusA 缩写:PVA 分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。 马铃薯A病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 基于胶体金免疫层析双抗体夹心检测法原理,采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规 胶体金免疫层析试纸条进行处理,提高检测灵敏度,根据试纸条颜色的变化,判定待测样品中是否存在 马铃薯A病毒。 5 仪器设备、用具及试剂材料 5.1 仪器设备 天平(感量,1/10000g)、离心机、组织捣碎机、低温冰箱等。 5.2 用具 微量移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)、研钵、离心管等。 1GB/T28974—2012 5.3 试剂材料 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定马铃薯A病毒试剂材料(见附录B)。 6 实验步骤 6.1 生物安全与废弃物处理 实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489的规定进行操作,实验废弃物按照 GB/T23629—2009中5.7进行处理。 6.2 样品制备 称取1g植物或其产品组织,加入2mL样品提取缓冲液用研钵研磨,然后4℃下3000g~5000g 离心10min,取上清液制备成一个样品。 6.3 样本存放 制备的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h,若需长期保存,应置-70℃以下,避免反复 冻融。 6.4 病毒检测 6.4.1 检测步骤 取同一批次胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条(即开即用),置于平整的台面上,向样品垫中分别 加入被检样品、阳性对照和阴性对照各100μL,每个试验同时做平行。室温放置15min,观察检测线和 质控线条带。 6.4.2 质量控制 质控线条带出现颜色,阳性对照检测线条带出现颜色,阴性对照检测线条带不出现颜色,检测结果 有效。如果质控线条带不出现颜色,或阳性对照检测线条带不出现颜色,或阴性对照检测线条带出现颜 色,出现任何一种现象以上者,说明检测结果无效,另选一批次试纸条重新按6.4.1操作。 6.4.3 增敏实验 向检测线没有产生颜色条带的试纸条样品垫上加入100μL的PBST缓冲溶液进行清洗,反复清洗 3次,每次1min,然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加入30μL增敏试剂,室温反应5min~8min后, 观察检测线条带颜色。 6.4.4 结果判定 检测线条带出现颜色,判定为阳性;检测线条带不出现颜色,判定为阴性。 注:增敏前条带颜色为红色,增敏后因为氧化还原反应使条带颜色变为黑灰色。 7 结果的确认 可疑阳性样品应采用马铃薯A病毒RT-PCR检测方法进行确认。 2GB/T28974—2012 8 样品的保存与复核 种子类样品保存6个月,如果发现带毒样品保存1年。植株中发现病毒的,采集病叶干燥后保存于 -20℃条件。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档,以便必要时复核。复核程 序按照GB/T23632—2009中第6章进行操作。 3GB/T28974—2012 附 录 A (资料性附录) 马铃薯A病毒相关资料 A.1 寄主范围 马铃薯A病毒的自然寄主为马铃薯(Solanumtuberosum);人工接种可侵染的植物(包括鉴别寄 主)为番茄(Lycopersiconesculentum和L.pimpinellifolium)、假酸浆(Nicandraphysaloides)、烟草 (Nicotianadebneyi、N.glauca、N.glutinosa、N.sanderae、N.sylverstris、N.tabacumcv.Samsun和 N.tabacumcv.WhiteBurley)、Solanumdemissum×S.tuberosumcv.Aquila(=A6hybrid)、S.demis- sum“SdA”和Daturameteloides。 A.2 病害症状 多数马铃薯受该病毒侵染无明显症状,有的品种表现出轻型花叶、脉间叶组织凸起呈褶皱状、叶脉 或叶脉间呈现不规则浅色斑及叶缘呈波状等症状。 A.3 分布地区 马铃薯A病毒分布于很多马铃薯重要产区,可存在于种薯、组培苗中,在欧洲各国、日本、美国、新 西兰以及中国的福建、黑龙江、云南等地均有分布。 A.4 传播方式 该病毒可通过汁液、种薯及介体蚜虫(Aphisfrangulae、A.nasturtii、Macrosiphonsolanifolu、 Myzuspersicae及Neomyzuscirumflexus等)传播。 4GB/T28974—2012 附 录 B (规范性附录) 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定马铃薯A病毒试剂材料 B.1 胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条 样品垫为玻璃纤维素片;结合垫是喷好了金标马铃薯A病毒单克隆抗体的玻璃纤维素片,免疫金 释放时间小于5min,释放效率大于80%;硝酸纤维素膜的检测线上包被了马铃薯A病毒多克隆抗体; 质控线上包被了1mg/mL的羊抗鼠IgG;吸水垫为吸水纸。其结构见图B.1。 其中:玻璃纤维素片:吸水速率大于4s/cm,吸水量大于50mg/cm2; 硝酸纤维素膜(NC膜):毛细流动速率大于25s/cm; 吸水纸:吸水速率大于3s/cm,吸水量大于100mg/cm2; 聚氯乙烯(PVC)板:初粘力大于或等于3号球,持粘力标准条件下大于80h。 图B.1 胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条 B.2 样品提取缓冲液 PBST 1L 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g PVP(MW24000~40000) 20g 叠氮钠(NaN3) 0.2g 4℃储存。 B.3 PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4) 氯化钠(NaCl) 8g 5GB/T28974—2012