ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29578—2013 甘 蔗白色条纹病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofXanthomonasalbilineans(Ashby)Dowson 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局、重庆大学。 本标准主要起草人:刘鹏、刘跃庭、崔铁军、王中康、廖芳、张裕君、冯洁、黄国明。 ⅠGB/T29578—2013 甘蔗白色条纹病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了甘蔗白色条纹病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于甘蔗蔗苗、茎秆等植物材料中甘蔗白色条纹病的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 甘蔗白色条纹病菌基本信息 中文名:甘蔗白色条纹病菌。 学名:Xanthomonasalbilineans(Ashby)Dowson。 病害英文名:sugarcaneleafscalddisease。 属细菌界Bacteria,变形细菌门Proteobacteria,γ-变形细菌纲Gammaproteobacteria,黄单胞菌目 Xanthomonodales,黄单胞菌科Xanthomonodaceae,黄单胞菌属Xanthomonas。 主要靠感病株和机械传播;被感染的种蔗是该病传播的主要方式,削刀(包括装载机械化切刀)也是 一个重要的传播源。夹风雨、啮齿动物以及甲虫、蝗虫、叶蝉和甘蔗螟虫等害虫也是甘蔗白色条纹病的 传播途径。 甘蔗白色条纹病菌的其他基本信息参见附录A。 4 方法原理 依据甘蔗白色条纹病菌在寄主植物上造成的病害症状特征,以及该病原菌的生物学特性、生理生化 特性、分子生物学特性和致病性特征等进行检测鉴定。 5 仪器用具 电子天平(感量0.0001g)、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜、 高速冷冻离心机(12000r/min)、掌上离心机、纯水仪、恒温水浴锅、BIOLOG细菌自动鉴定系统、细菌 微量生化鉴定管、低温冰箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、真空冷冻干燥机、培养皿(直径90mm)、可调 式微量进样器(10μL、100μL、200μL、1000μL、)、研钵、离心管(1.5mL)、PCR管(0.2μL)、一次性注 射器(2mL)等。 1GB/T29578—2013 6 试剂和培养基 6.1 试剂 酵母膏、蛋白胨、蔗糖、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、磷酸氢二钾(K2HPO4)琼脂粉、氯化镁(MgCl2)、 dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、TaqPolymerase、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、盐酸(HCl)、冰乙酸(C2H4O2)、溴化乙锭(C21H20N3Br)、琼脂糖、DNAMarker等。 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,所有试验用水均为灭菌双蒸水。 6.2 培养基 YSP培养基、523培养基,配制方法见附录B。 7 检疫鉴定方法及步骤 7.1 现场检疫 甘蔗种植园的病害调查或进出境甘蔗样品的现场检疫中,若发现甘蔗植物叶片出现与叶脉平行的 白色细长条纹,有的白色组织中有很小的红褐色斑点或很浅的红线,或出现红色坏死条纹,有的严重的 植株叶片呈现白色枯萎症状(详见附录A中描述),应取甘蔗基部茎秆(地上部分)2节~4节带回实验 室做进一步分离鉴定。在进出境检疫中,对于没有症状的甘蔗样品,同样取茎基部部分,取样方法和步 骤参照SN/T2122。 7.2 病原菌分离 将甘蔗茎秆表面清洗后,用75%酒精擦拭消毒。用灭菌的刀具横切茎秆,观察横断面是否有菌脓 渗出。若没有发现菌脓,则用灭菌手术刀切取茎秆内部组织小块若干,放入灭菌的研钵中将组织液研 出,吸取1mL组织液加入1.5mL离心管中,8000r/min离心10min,弃去上清液后将沉淀用1mL 无菌水稀释,该稀释液1mL再进行系列浓度的稀释,稀释倍数分别为10倍,100倍,1000倍,10000倍, 100000倍(取5个PCR管,分别加入0.9mL无菌水,从稀释液开始,浓度由高到低依次加入0.1mL无菌 水)。将每个浓度的稀释液在YSP培养基平板(直径90mm)上进行涂布,20μL/平板,每个浓度做3个 平板。 若发现茎秆断面有渗出的菌脓,可直接用接种环蘸取并在YSP培养基平板上划线分离。每份样品 做不少于3个平板即可。 将涂布或划线分离的YSP培养基平板置于30℃恒温培养箱中进行培养。 7.3 培养筛选 经涂布或划线分离的YSP培养基平板在30℃条件下培养48h~72h后观察是否有直径达到1mm 左右、黄色或浅黄色、光亮、平滑、圆整的可疑菌落产生。 挑取可疑单菌落进行分离纯化,之后再转接2次进行纯化。 对纯化的可疑菌落进行7.5~7.7步骤的检测。 若未发现可疑菌落则判定该样品检验结果为未检出甘蔗白色条纹病菌。 7.4 革兰氏染色 检测方法和步骤参照GB/T4789.28。 2GB/T29578—2013 7.5 生化指标测定 应用细菌微量生化鉴定管对可疑菌株进行以下12项生化指标的检测:果糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘 露糖、山梨醇、木糖、木糖醇、纤维糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖、酒石酸盐。 或应用BIOLOG细菌自动鉴定系统进行鉴定。 7.6 分子生物学测定 分子生物学检测中安全措施方面的要求参照SN/T1193。 分子生物学测定的具体试验方法和试剂配制见附录B。采用特异性引物XAF1/XAR1对可疑菌 株进行PCR检测,用甘蔗白色条纹病菌标准菌株作阳性对照,用黄单胞属非甘蔗白色条纹病菌的植物 病原细菌作阴性对照,用水作空白对照,进行PCR扩增,扩增产物进行电泳分析。在阳性对照扩增片段 大小为600bp的单带,且阴性对照和空白对照未有扩增条带的前提下,可疑菌株扩增结果与阳性对照 一致,可判定分子生物学检测结果为阳性。 7.7 致病性测定 用甘蔗感病品种(新台糖16号、粤糖65等)植株进行致病性测定,接种方法采用注射接种方法,试 验设置阴性(无菌生理盐水接种)和阳性对照。温度为白天32℃,晚间26℃,光照12h,相对湿度 为70%。 应用温室中培养的1月龄蔗苗,取在523培养基上培养24h的菌株,用无菌生理盐水配制细菌悬 浮液(108CFU/mL),用注射器将菌悬液注入蔗苗茎秆基部约0.5mL。接种5d~7d后观察症状,顶 端叶片是否有白色条纹或叶片的白化枯萎症状是否出现。 8 结果判定 分离纯化得到的细菌菌株同时符合以下五个方面的检测结果,则可以判定检出甘蔗白色条纹病菌。 a) 在YSP培养基上的菌落特征与7.3中描述相符。 b) 革兰氏染色结果为阴性杆菌。 c) 生化指标测定中,果糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、山梨醇、木糖检测结果为阳性。木糖醇、纤 维糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖、酒石酸盐检测结果为阴性。或经BIOLOG细菌自动鉴定系统 检测判定为甘蔗白色条纹病菌。 d) 分子生物学检测结果为阳性。 e) 致病性检测表现典型症状。 9 样品保存 检出甘蔗白色条纹病菌的样品至少保存6个月,以备复检、谈判和仲裁;保存期满后,需经灭菌后方 可处理。 10 菌种保存 分离并最终鉴定为甘蔗白色条纹病菌的菌株应转接到523试管斜面上,经登记和经手人签字后置 于4℃低温冰箱中保存,30d~60d转接一次,以防止病菌死亡,以备复核、谈判和仲裁。必要时将菌株 用真空冷冻干燥机冻干后长期保存。 3GB/T29578—2013 附 录 A (资料性附录) 甘蔗白色条纹病菌的其他信息 A.1 分布 贝宁、布基纳法索、喀麦隆、加纳、肯尼亚、象牙海岸、马达加斯加、马拉维、毛里求斯、摩洛哥、莫桑比 克、多米尼加、尼日利亚、留尼汪、南非、斯威尔兰、多宁、坦桑尼亚、刚果、津巴布韦、扎伊尔、缅甸、柬埔 寨、印度、印度尼西亚、日本、巴基斯坦、菲律宾、伊拉克、斯里兰卡、泰国、越南、澳大利亚、斐济、夏威夷、 墨西哥、美国、巴巴多斯、古巴、格林纳达、瓜德罗普、危地马拉、牙买加、马提尼克、巴拿马、波多黎各、圣 基茨、圣卢西亚、圣文森特、特立尼达和多巴哥、阿根廷、巴西、乌拉圭、圭亚那、苏里南、巴拉圭、委内瑞 拉、中国(台湾、江西、广东、福建)。 A.2 寄主范围 甘蔗(Sacchaeruofficinarum)、玉米(Zeamays)、象草(Pennisetumpurpureum)等。 A.3 危害 甘蔗白色条纹病也称甘蔗叶灼病,属系统性病害,由于蔗茎维管束被病菌粘液淤塞,影响水分运输, 致使甘蔗叶片的条纹坏死,在干旱季节会发生整株的突然枯萎死亡。该病害常为潜伏侵染,细菌获得机 会活跃时,才呈现外表病征,有慢性型和急性型,潜伏期不表现症状。 急性型症状:典型特征是茎杆突然萎缩枯死,而不表现其他的任何症状。有时从茎杆基部或节间侧 生叶片具有典型的细长条斑的边鞘。 慢性型症状:病初叶片出现1mm~2mm宽的与叶脉平行的白色细长条纹,其数目、长度不一,或 细小,或整片叶变白,变白程度亦不尽相同,有的