ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29581—2013 胡 椒叶斑病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofXanthomonasaxonopodispv.betlicola (Pateletal.)Vauterinetal. 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国海南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫 局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:刘福秀、冯黎霞、龙海、李伟东、凌杏园、韩玉春、周先超。 ⅠGB/T29581—2013 胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了胡椒叶斑病菌(Xanthomonasaxonopodispv.betlicola)的检疫和鉴定方法。 本标准适用于植物苗木等繁殖材料及组织中胡椒叶斑病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T4789.28—2003 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 3 胡椒叶斑病菌基本信息 中文名:胡椒叶斑病菌(胡椒细菌性叶斑病菌;地毯草黄单胞杆菌蒌叶致病变种)。 学名:Xanthomonasaxonopodispv.betlicola(Patel,Kulkarni&Dhande1951)Vauterin,Hoste, Kersters&Swings1995。 异名:Xanthomonascampestrispv.betlicola(Patel,Kulkarni&Dhande1951)Dye1978。 病害英文名:bacterialleafspotofpepper、pepperbacterialleafspot。 属原核生物界Procaryotes、变形细菌门Proteobacteria、γ-变形细菌纲Gammaproteobacteria、黄单 胞菌目Xanthomonadales、黄单胞菌科Xanthomonadaceae、黄单胞菌属Xanthomonas、地毯草黄单胞杆 菌Xanthomonasaxonopodis。 胡椒叶斑病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 根据胡椒叶斑病菌的寄主范围、培养性状、生理生化特性和所致病害的症状特点,采用病原菌的分 离、病菌培养性状观察、生理生化特性检测以及致病性测定等方法进行检测和鉴定。 5 试剂与培养基 5.1 试剂 无菌水、琼脂、酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、营养琼脂、牛肉膏、氯化钠、氢氧化钠。 果糖、木糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、海藻糖、甘油、水杨苷、蔗糖、山梨糖、鼠李糖、棉子糖、肌 醇、草酸钠、β-羟基丁酸钠、琥珀酸钠、苹果酸、乳酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、DL-精氨酸明胶、石蕊牛奶。 5.2 培养基 病菌分离采用NGA培养基(见附录B),病菌增殖采用营养琼脂培养基(见附录B)。 1GB/T29581—2013 6 仪器和用具 天平、搅拌器、冰箱(4℃±2℃;-80℃)、无菌(新)塑料封口袋、脱脂棉、石棉铁丝网、高压灭菌锅、 培养箱(29℃±1℃;或其他可以控制温度的暗室)、无菌昆虫针、紫外灯、小型离心机、酸度计(或精密 pH试纸)、超净工作台等。 7 检测与鉴定 7.1 现场检疫 7.1.1 感官检查 仔细检查,观察典型症状或可疑症状(参见附录A)。感病组织表面可能有菌脓。 7.1.2 样品抽取 发现可疑植株,切取受害部位或将整棵植株取回实验室检验。 7.2 室内检测与鉴定 7.2.1 病原菌分离 取小块病组织用无菌水冲洗后放入0.5mL~2.0mL无菌水中,观察是否有细菌溢出。如果有喷 菌现象,则用接种环挑取喷出的菌液,在NGA培养基(参见附录B)上划线分离。如没有喷菌现象,则 用灭菌玻棒将病组织研碎,在室温下浸泡15min~20min,用接种环挑取组织液在NGA培养基上划线 分离。看不到症状的情况下,用无菌水洗涤病组织(病组织为叶片时,洗涤量应在10片以上),洗涤液离 心浓缩后做适当稀释,在NGA培养基上划线分离。划线细菌在28℃~30℃下黑暗培养。至少设2个 重复。3d后即可观察所产生的菌落。如果发现可疑的菌落应该及时使用NGA培养基进一步纯化培 养观察,并进行后续试验。 7.2.2 菌落形态观察 配制表1所列9种培养基,并按表1所列培养条件培养待检菌株,其中1是必需的,2~9可选。 表1 胡椒叶斑病菌在不同培养基上的培养性状 序号 培养基 培养条件 典型培养性状 1 营养琼脂 28℃~30℃下培养7d 菌落圆形,黄色,有光泽,全缘,稍隆起,粘稠 2 牛肉膏胨培养液 28℃~30℃下振荡培 养24h或静止培养7d 培养液轻度浑浊,无液面生长,沉淀物不明显 3 牛肉膏胨琼脂平面 28℃~30℃下培养7d 菌落圆形,直径1mm~2mm,表面光滑,闪光,边缘 完整,乳酪状,低度凸起,半透明或不透明,乳白带浅 黄色 4 酵母膏胨培养液 28℃~30℃下振荡培 养24h或静止培养7d 培养液轻度浑浊,无液面生长,沉淀物不明显 5 牛肉膏胨酵母葡萄 糖培养液 28℃~30℃下振荡培 养24h或静止培养7d 培养液中度浑浊,液面生长环状,沉淀物少量 2GB/T29581—2013 表1(续) 序号 培养基 培养条件 典型培养性状 6 牛肉膏胨酵母葡萄 糖琼脂斜面 28℃~30℃下培养7d 菌苔均为线状,快速生长,乳酪状,不粘稠,乳白带浅 黄色,培养基不变色 7 牛肉膏胨酵母葡萄 糖琼脂平板 28℃~30℃下培养7d 菌落圆形,直径3mm~5mm,表面光滑,闪光,边缘 完整,乳酪状,低度凸起,半透明或不透明,乳白带浅 黄色 8 牛肉膏胨琼脂斜面 28℃~30℃下培养7d 菌苔均为线状,中度生长,乳酪状,不粘稠,乳白带浅 黄色,培养基不变色 9 酵母膏胨琼脂斜面 28℃~30℃下培养7d 菌苔均为线状,中度生长,乳酪状,不粘稠,乳白带浅 黄色,培养基不变色 发现典型菌落的结果判为阳性,同时记录可疑菌落数,并进行后续试验。如没有发现典型的菌落, 结果判为阴性。 7.2.3 革兰氏染色 革兰氏染色按GB/T4789.28—2003中2.2的规定进行试验。观察革兰氏染色反应的试验结果和 菌体形态。 胡椒叶斑病菌革兰氏染色呈阴性反应。典型菌体短杆状,末端圆形,大小为(0.4μm~0.7μm)× (1.0μm~2.4μm),单个或成双排列,有3~5个的短链。无芽孢,无荚膜,有运动性,鞭毛为单根极生。 革兰氏染色呈阴性反应,且观察到菌体典型形态的结果判为阳性,并进行后续试验。如革兰氏染色 反应呈阳性,或革兰氏染色反应呈阴性但没有观察到菌体典型形态,结果判为阴性。 7.2.4 生理生化特性测定 将上述分离的等检细菌用微量生化反应管进行生理生化特性测定。以X.axonopodispv.betlicola 阳性菌株做对照,每个测定项目设3个重复。生理生化特性测定结果与附录C结果一致判定为阳性, 并进行致病性测定。否则判为阴性。 7.3 致病性测定 7.3.1 针刺接种 采用平板划线法在营养琼脂培养基平板上纯化刚分离的待测细菌,在28℃~30℃温度下培养 2d~4d,移出单个菌落后进一步扩大繁殖。取待测细菌在营养琼脂培养基上培养24h~48h,用灭菌 的昆虫针蘸取菌落,在胡椒苗嫩叶背面进行刺伤接种(Pan-niyur系列品种或其他品种都行,国内主栽品 种都感病)。每个菌株接种3片叶。接种标准的阳性菌株作为阳性对照,同时接种非致病菌和无菌水作 为阴性对照。接种后的植株置放于人工气候箱,在28℃~30℃温度下,先在100%相对湿度下保湿 24h~48h,然后在80%左右的相对湿度下,每天在7000lx~10000lx下光照培养16h,黑暗下培养 8h。接种5d~7d后,观察是否出现水渍状角形病斑,每天观察一次,接种后30d不表现症状的视为 不发病。试验重复3次。 用喷雾法接种于胡椒或蒌叶叶片上也能产能水渍状多角形病斑。 3GB/T29581—2013 7.3.2 病菌再分离 按7.2.1的方法对7.3.1中发病的植株进行病菌再分离,能得到7.2.2描述的纯培养判为阳性,否则 判为阴性。 8 结果评定 没有发现典型的菌落,即菌落形态观察结果为阴性,判定为未检出胡椒叶斑病菌。 革兰氏染色呈阳性反应,即革兰氏染色结果为阴性,判定为未检出胡椒叶斑病菌。 生理生化特性测定结果与附录C结果不一致,即生理生化特性测定结果为阴性,判定为未检出胡 椒叶斑病菌。 致病性测定试验中,接种后没有出现典型症状,或出现了典型症状但没有从接种后发病的组织中再 分离到与原接种物相同的病原菌,即致病性测定结果为阴性,判定为未检出胡椒叶斑病菌。 菌落形态观察结果、革兰氏染色结果、生理生化特性测定结果和致病性测定结果四者均为阳性,判 定为检出胡椒叶斑病菌。 9 样品和菌种保存 9.1 样品保存 样品(包括健康和发病的植株或组织)拍照后均应制成干标本,经登记和签字后置于4℃冰箱或阴 凉干燥、防虫防鼠处妥善保存。对鉴定为胡椒叶斑病菌的样品至少应保存6个月,以备复检、谈判和仲 裁,样品保存期满后,需经灭菌处理。 9.2 菌种保存 从样品中分离并鉴定为胡椒叶斑病菌的新鲜菌种在营养琼脂培养基上2