ICS71.100.70 Y42 中华人民共和国国家标准 GB/T29664—2013 化 妆品中维生素B3(烟酸、烟酰胺)的测定 高效液相色谱法和 高效液相色谱串联质谱法 DeterminationofvitaminB3(nicotinicacidandnicotinamide) incosmetics—HPLCandHPLC-MS/MS 2013-09-06发布 2014-02-15实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会(SAC/TC257)归口。 本标准起草单位:大连市产品质量监督检验所(国家日化产品质量监督检验中心)、上海市日用化学 工业研究所(国家香料香精化妆品质量监督检验中心)、大连标准检测技术研究中心。 本标准主要起草人:毛希琴、郑顺利、胡侠、孙稚菁、吴海霞、潘炜、武晓剑、康薇。 ⅠGB/T29664—2013 化妆品中维生素B3(烟酸、烟酰胺)的测定 高效液相色谱法和 高效液相色谱串联质谱法 1 范围 本标准规定了化妆品中维生素B3(烟酸、烟酰胺)测定的高效液相色谱法及高效液相色谱串联质 谱法。 本标准适用于膏霜、乳液、化妆水、皂基如美容皂、蜡基如唇膏等化妆品中维生素B3(烟酸、烟酰胺) 的定量测定,其中高效液相色谱法对烟酸、烟酰胺的检出限均为2μg/g,定量限均为6μg/g;高效液相 色谱串联质谱法对烟酸、烟酰胺的检出限均为100μg/kg,定量限均为300μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 烟酸、烟酰胺为极性化合物易溶于水相,化妆品中的油溶性成分易溶于有机相,而化妆品中的表面 活性剂则富集于有机相与水相界面处。利用水和二氯甲烷(或异辛烷)双液相体系将目标物与化妆品中 油溶性成分及表面活性剂初步分离。酸性条件下用反相及强阳离子交换混合型固相萃取材料吸附富集 目标物,脱除干扰物质后,洗脱,定容,用反相高效液相色谱分离,二极管阵列检测器检测(高效液相色谱 法)或串联四级杆质谱检测(高效液相色谱串联质谱法),标准曲线外标法定量。 4 试剂和材料 除非另有规定,所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 甲醇:色谱纯。 4.2 甲醇:分析纯。 4.3 氨水:分析纯。 4.4 甲酸:色谱纯。 4.5 甲酸:分析纯。 4.6 二氯甲烷:分析纯。 4.7 异辛烷:分析纯。 4.8 2%甲酸水溶液:移取2mL甲酸(4.5),用水稀释定容至100mL。 4.9 2%氨水氨化甲醇:移取2mL氨水(4.3),用甲醇稀释定容至100mL。 4.10 1%甲酸水溶液:移取1mL甲酸(4.5),用水稀释定容至100mL。 1GB/T29664—2013 4.11 Strara-X-C固相萃取小柱或相当者:60mg,3mL。使用前,依次用2mL甲醇和2mL水活化。 4.12 标准储备液:准确称取烟酸和烟酰胺标准物质各250mg分别置于两个25mL的棕色容量瓶中, 用蒸馏水溶解定容,配置成浓度为10mg/mL的标准储备溶液,于4℃~6℃条件下保存。保存期一般 不应超过2周。 4.13 系列标准溶液 4.13.1 系列标准溶液A:首先将两种标准储备液等体积混合,配置成5mg/mL的混合标准溶液,然 后用2%甲酸水(4.8)稀释配置成烟酸和烟酰胺浓度均分别为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、 50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的系列标准混合溶液用于液相色谱测试。以上系列 标准溶液,均需现用现配。 4.13.2 系列标准溶液B:首先将两种标准储备液等体积混合,配置成5mg/mL的混合标准溶液,然后 用2%甲酸水(4.8)稀释配置成烟酸和烟酰胺浓度均分别为5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、 500μg/L、1000μg/L的系列标准混合溶液用于液质联用测试。以上系列标准溶液,均需现用现配。 4.14 0.2μm微孔尼龙滤膜。 4.15 标准物质见表1。 表1 标准物质英文名称、INCI名称、CAS号、分子式、分子结构式、相对分子质量、纯度 化合物名称 烟 酸 烟酰胺 英文名称 Nicotinicacid Nicotinamide INCI名称 Niacin Niacinamide CAS号 59-67-6 98-92-0 分子式 C6H5NO2 C6H6N2O 分子结构式 相对分子质量 123.11 122.13 纯度 ≥99.0% 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(高效液相色谱法)。 5.2 高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪(ESI源)(高效液相色谱串联质谱法)。 5.3 分析天平:感量0.1mg;0.01mg。 5.4 氮吹仪。 5.5 漩涡混合器。 5.6 超声波清洗器。 5.7 离心机:转速不小于5000r/min,离心试管容量15mL。 5.8 移液枪或移液器。 2GB/T29664—2013 6 试样制备 6.1 膏霜、乳液、化妆水、洗发水等化妆品样品的制备 6.1.1 称取0.2g样品(精确至0.01g)于15mL具塞塑料离心管中,60℃条件下氮吹,尽量除去样品 中的水分。向离心管中准确加入4mL2%甲酸水溶液(4.8),涡旋混合使样品均匀分散后超声15min~ 30min,向离心管中加入3mL二氯甲烷(4.6),涡旋混合2min,然后于5000r/min离心5min~ 20min。 6.1.2 准确移取1mL上层溶液过Strara-X-C固相萃取小柱(4.11),待自然流干后,依次加入1mL 1%甲酸水溶液(4.10)和1mL甲醇(4.2)淋洗柱床,最后添加4mL2%氨水氨化甲醇(4.9)进行洗脱, 待自然流干后,吹出柱床内溶液并收集所有流出溶液,氮吹挥干溶剂,准确添加1mL水溶解,涡旋混合 1min,确保瓶内残留物全部溶解后,用0.2μm微孔尼龙滤膜过滤,待测。 6.2 美容皂等固态基类化妆品样品的制备 6.2.1 用刮铲或小刀将皂基样品刨成碎屑或丝状薄片,刨碎后迅速密封在容器中,并尽快进行称量。 称取0.2g(精确至0.01g),于15mL具塞塑料离心管中,先向离心管中准确加入4mL2%甲酸水溶液 (4.8)并置于沸水浴中5min~10min使皂基融化,涡旋混合使样品溶解并均匀分散,待冷却,继续向离 心管中加入3mL二氯甲烷(4.6),涡旋混合2min后,于5000r/min离心5min~20min。 6.2.2 余下步骤与6.1.2相同。 注:由于皂基变成碎屑或薄片时,样品表面积显著增大,皂中的水分会迅速挥发,带来称量误差。因此建议尽量缩 短取皂、碎皂及称量的时间,且实验室湿度高于50%,温度低于25℃。 6.3 唇膏等蜡基化妆品样品的制备 6.3.1 称取0.2g样品(精确至0.01g)于15mL具塞塑料离心管中,向离心管中加入2mL异辛烷 (4.7),涡旋。若样品不能够完全分散,需将离心管置于80℃水浴中3min~5min,待样品完全融化后, 向离心管中准确加入4mL2%甲酸水溶液(4.8)(80℃水浴预热),涡旋1min后,将离心管重新置于 80℃水浴平衡5min,取出再涡旋1min。若样品能够完全分散,则无需水浴加热,直接向离心管中准确 加入4mL2%甲酸溶液(4.8)(80℃水浴预热),涡旋2min。必要时于5000r/min离心5min~ 20min。 6.3.2 取1mL下层水相,0.2μm微孔尼龙滤膜(4.14)过滤,待测。如遇干扰,可参照步骤6.1.2对 样品进行净化处理。 注:对烟酸、烟酰胺含量超过1%的化妆品样品建议将提取溶液2%甲酸水溶液的体积增加为8mL,其他条件不变, 以避免超出固相萃取小柱的柱负载量,导致目标物回收率的降低。 7 分析步骤 7.1 高效液相色谱法 7.1.1 液相色谱分析参考条件 液相色谱测定的参考条件如下: a) 色谱柱:SB-Aq(或相当者),1.8μm,3mm×100mm; b) 柱温:30℃; c) 流动相:A为100%水(含0.1%甲酸);B为100%甲醇(含0.1%甲酸); 3GB/T29664—2013 d) 流速:0.3mL/min; e) 检测波长:260nm; f) 进样量:2μL; g) 液相色谱分离条件见表2。 表2 液相色谱分离条件 时间/min 流速/(mL/min) 流动相A/% 流动相B/% 0 0.3 100 0 6.0 0.3 100 0 6.1 0.3 40 60 9.0 0.3 40 60 9.1 0.3 100 0 13.0 0.3 100 0 注1:0~6min为色谱分离过程,6min~9min为洗脱强保留杂质的过程,9min~13min为色谱柱重新平衡 过程。 注2:若上述液相色谱条件下遇到干扰,可改用100%水(含0.1%乙酸)为A相重新进行测试。B相相应改为 60%甲醇水溶液(含0.1%乙酸),相应流动相切换时间也需根据情况进行调整。 注3:柱的内径和长度及色谱填料粒径可根据色谱分离情况自由选择。 7.1.2 定性分析 将在相同的液相色谱条件下获得的样品溶液的液相色谱分离谱图与标准物质的液相色谱分离谱图 进行比较,若样品谱图中存在保留时间与某标准物质的保留时间一致的色谱峰,并且其扣除背