ICS67.140.10 X04 中华人民共和国国家标准 GB/T30483—2013 茶 叶中茶黄素的测定 高效液相色谱法 Determinationoftheaflavinsintea—Highperformanceliquidchromatography 2013-12-31发布 2014-06-22实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华全国供销合作总社提出。 本标准由全国茶叶标准化技术委员会(SAC/TC339)归口。 本标准起草单位:中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院、国家茶叶质量监督检验中心。 本标准主要起草人:周卫龙、徐建峰、陆小磊、许凌、叶美君。 ⅠGB/T30483—2013 茶叶中茶黄素的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了用高效液相色谱(HPLC)测定茶及茶制品中茶黄素含量的仪器、试剂、操作方法、结 果计算。 本标准适用于茶及茶制品中茶黄素含量的测定,也适用于咖啡碱、儿茶素及没食子酸的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T8302 茶 取样 GB/T8303 茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定 3 原理 茶叶磨碎试样中的茶黄素(儿茶素)用70%的甲醇溶液在70℃水浴上提取,速溶茶用热的10%乙 腈溶解。茶黄素(儿茶素)的测定用C18柱、检测波长278nm、梯度洗脱、HPLC分析,用茶黄素(儿茶素) 标准物质外标法直接定量。 4 仪器 4.1 分析天平:感量0.0001g。 4.2 水浴。 4.3 离心机:转速3500r/min。 4.4 混匀器。 4.5 高效液相色谱仪(HPLC):包含梯度洗脱及紫外检测器(检测波长278nm)。 4.6 液相色谱柱:C18(粒径5μm,250mm×4.6mm)。 5 试剂 5.1 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯(AR),水为蒸馏水。 5.2 乙腈:色谱纯。 5.3 甲醇。 5.4 冰乙酸。 5.5 70%甲醇水溶液(体积分数)。 5.6 10mg/mLEDTA-2Na溶液:现配。 5.7 10mg/mL抗坏血酸溶液:现配。 5.8 稳定溶液:分别将25mLEDTA-2Na溶液(5.6),25mL抗坏血酸溶液(5.7),50mL乙腈(5.2)加 1GB/T30483—2013 入500mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。 5.9 液相色谱流动相 5.9.1 流动相A:分别将90mL乙腈(5.2),20mL冰乙酸(5.4),2mLEDTA-2Na(5.6)加入1L容量 瓶中,用水定容至刻度,摇匀。溶液需过0.45μm膜。 5.9.2 流动相B:分别将800mL乙腈(5.2),20mL冰乙酸(5.4),2mLEDTA-2Na(5.6)加入1L容量 瓶中,用水定容至刻度,摇匀。溶液需过0.45μm膜。 5.10 标准储备溶液 5.10.1 咖啡碱储备溶液:2.00mg/mL。 5.10.2 没食子酸(GA)储备溶液:0.100mg/mL。 5.10.3 儿茶素储备溶液:+C1.00mg/mL,EC1.00mg/mL,EGC2.00mg/mL,EGCG2.00mg/mL, ECG2.00mg/mL。 5.10.4 茶黄素储备溶液:TF2.00mg/mL,TF-3-G2.00mg/mL,TF-3′-G2.00mg/mL,TFDG2.00 mg/mL。 5.11 标准工作溶液:用稳定溶液(5.8)配制。 标准工作溶液的浓度:没食子酸5μg/mL~25μg/mL、咖啡碱50μg/mL~150μg/mL、 +C50μg/mL~150μg/mL、EC50μg/mL~150μg/mL、EGC100μg/mL~300μg/mL、EGCG 100μg/mL~400μg/mL、ECG50μg/mL~200μg/mL、TF100μg/mL~300μg/mL、TF-3-G 100μg/mL~300μg/mL、TF-3′-G100μg/mL~300μg/mL、TFDG100μg/mL~300μg/mL。 6 操作方法 6.1 取样 按GB/T8302的规定。 6.2 试样制备 按GB/T8303的规定。 6.3 测定步骤 6.3.1 干物质含量测定 按GB/T8303的规定。 6.3.2 供试液的制备 6.3.2.1 茶叶:称取0.2g(精确到0.0001g)均匀磨碎的试样(6.2)于10mL玻璃离心管中,加入在 70℃中预热过的70%甲醇溶液(5.5)5mL,用玻璃棒充分搅拌均匀湿润,立即移入70℃水浴(4.2)中, 浸提10min(隔5min搅拌一次),浸提后冷却至室温,转入离心机(4.3)在3500r/min转速下离心 10min,将上清液转移至10mL容量瓶。残渣再用5mL的70%甲醇溶液提取一次,重复以上操作。 合并提取液定容至10mL,摇匀(该提取液在4℃下可至多保存24h)。用移液管移取上述提取液2mL 至10mL容量瓶中,用稳定溶液(5.8)定容至刻度,摇匀,过0.45μm膜,待测。 6.3.2.2 速溶茶:称取0.5g(精确到0.0001g)均匀的速溶茶于50mL容量瓶,加入不高于60℃的水 溶解,加5mL乙腈(5.2)并用水定容至刻度,摇匀。用移液管移取上述提取液2mL至10mL容量瓶 中,用稳定溶液(5.8)定容至刻度,摇匀,过0.45μm膜,待测。 2GB/T30483—2013 6.3.3 色谱条件 流动相流速:1mL/min;柱温:35℃;紫外检测器:λ=278nm。 梯度条件: 100%A相保持10min ↓ 15min内由100%A相→68%A相、32%B相 ↓ 68%A相、32%B相保持10min; ↓ 100%A相 6.3.4 测定 待流速和柱温稳定后,进行空白运行。准确吸取10μL混合标准系列工作液注射入HPLC。在相 同的色谱条件下注射10μL测试液。测试液以峰面积定量。 7 结果计算 7.1 计算方法 茶叶中茶黄素(儿茶素、咖啡碱、没食子酸)含量以干态质量分数(%)表示,按式(1)计算: 茶黄素(儿茶素、咖啡碱、没食子酸)含量=A×fStd×V×d m×106×w×100% ……(1) 式中: A ———所测样品中被测成分的峰面积; fStd———所测成分的校正因子(浓度/峰面积,浓度单位μg/mL); V———样品提取液的体积,单位为毫升(mL); d———稀释因子(通常为2mL稀释成10mL,则其稀释因子为5); m———样品称取量,单位为克(g); w———样品的干物质含量(质量分数),%。 7.2 茶黄素(儿茶素类)总量计算公式 茶黄素总量按式(2)计算: 茶黄素总量=TF+TF-3-G+TF-3′-G+TFDG ………………(2) 儿茶素总量按式(3)计算: 儿茶素总量=EGC+C+EC+EGCG+ECG……………………(3) 如果符合重复性(7.3),取两次测定的算术平均值作为结果,保留小数点后2位。 7.3 重复性 在重复条件下同一样品获得的茶黄素总量(儿茶素总量、咖啡碱含量,没食子酸含量)测定结果的绝 对差值不得超过算术平均值的10%。GB/T30483—2013 GB/T30483—2013 附 录 A (资料性附录) 儿茶素、茶黄素、咖啡碱和没食子酸标准样品液相色谱图 说明: 1———GA; 2———EGC; 3———C; 4———咖啡碱; 5———EC; 6———EGCG; 7———ECG; 8———TF; 9———TFDG; 10———TF-3-G; 11———TF-3′-G。 图A.1 儿茶素、茶黄素、咖啡碱和没食子酸标准样品液相色谱图 3102—38403T/BG