ICS07.060 A45 中华人民共和国国家标准 GB/T30744—2014 深 深海微生物样品前处理技术规范 Thetechnologyspecificationforthepre-treatmentofdeep-seamicroorganism samples 2014-06-09发布 2014-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅰ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语、定义和缩略语 1 ……………………………………………………………………………………… 4 试剂和材料 2 ……………………………………………………………………………………………… 5 仪器与设备 5 ……………………………………………………………………………………………… 6 一般规定 6 ………………………………………………………………………………………………… 7 样品现场处理 6 …………………………………………………………………………………………… 8 深海微生物菌种分离 8 …………………………………………………………………………………… 9 深海微生物基因组DNA提取 10 ………………………………………………………………………… 10 深海微生物宏基因组DNA提取 12 …………………………………………………………………… 11 深海生物样品及微生物资源保存 13 …………………………………………………………………… 附录A(资料性附录) 深海微生物样品前处理记录表格式 22 …………………………………………… 附录B(资料性附录) 耐压菌株分离 28 …………………………………………………………………… 附录C(资料性附录) 微生物菌种分子鉴定 29 …………………………………………………………… 附录D(资料性附录) 宏基因组Cosmid文库构建 32 …………………………………………………… 表A.1 深海样品采样记录表 22 …………………………………………………………………………… 表A.2 深海微生物分离鉴定记录表 22 …………………………………………………………………… 表A.3 深海微生物基因组DNA提取记录表 23 ………………………………………………………… 表A.4 深海样品宏基因组DNA提取记录表 23 ………………………………………………………… 表A.5 深海样品保藏记录表 24 …………………………………………………………………………… 表A.6 深海细菌保藏记录表 24 …………………………………………………………………………… 表A.7 深海放线菌保藏记录表 25 ………………………………………………………………………… 表A.8 深海真菌保藏记录表 26 …………………………………………………………………………… 表A.9 深海样品宏基因组DNA文库记录表 27 ………………………………………………………… 表C.1 16SrRNA基因通用引物的适用范围 29 ……………………………………………………………GB/T30744—2014 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家海洋局提出。 本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。 本标准起草单位:国家海洋局第三海洋研究所。 本标准主要起草人:曾润颖、邵宗泽、叶德赞、陈新华、林荣澄、孙凤芹、徐丽美、盖英宝。 ⅠGB/T30744—2014 深海微生物样品前处理技术规范 1 范围 本标准规定了深海微生物样品前处理中的技术要求、工作条件、深海样品现场处理、微生物及遗传 物质提取、保存及资料处理。 本标准适用于水深大于或等于1000m的深海微生物样品的现场处理、提取与保存。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T12763.4 海洋调查规范 第4部分:海洋化学要素调查 GB/T12763.6 海洋调查规范 第6部分:海洋生物调查 HY/T058 海洋调查观测监测档案业务规范 3 术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本文件。 3.1 术语和定义 3.1.1 深海 deepsea 水深大于或等于1000m的海洋区域。 3.1.2 微生物样品 microorganismsamples 已培养或已提取纯化的,具有一定科学意义,具有实际或潜在实用价值的,可直接应用于各种科学 研究的各种菌株(包括细菌、真菌、放线菌等)、DNA/RNA等遗传物质;以及包含上述菌株和遗传物质 的深海样品,包括水样、沉积物样、岩石样等。 3.1.3 前处理 pre-treatment 在开展深海微生物研究工作之前对采集自深海的各种微生物样品(见3.1.2)所进行的各种处理,包 括:深海生物样品现场处理、深海微生物菌种分离、深海微生物基因组DNA提取、深海微生物宏基因组 DNA提取、深海生物样品及微生物资源保藏。 3.1.4 低温微生物 cold-adaptedmicroorganism 在37℃以下的温度中生长良好的微生物(包括细菌、真菌、放线菌等),最适生长温度等于或低于 25℃。 3.1.5 嗜热微生物 thermophile 在等于或高于55℃的温度中生长良好的微生物(包括细菌、真菌、放线菌等)。 1GB/T30744—2014 3.1.6 宏基因组 metagenome 不经菌株分离筛选步骤,直接从环境样品中提取的遗传物质(DNA或RNA),包含了样品中所有微 生物的基因信息。 3.1.7 寡营养培养基 oligotraphicmedium 与正常培养基成分相同,但碳源、氮源营养物质浓度减为十分之一的培养基。 3.2 缩略语 16SrRNA:细菌染色体上编码核糖体RNA16S亚基的基因 18SrRNA:真核生物染色体上编码核糖体RNA18S亚基的基因 Amp:氨苄青霉素(Ampicillin) BOD:生化需氧量(Biochemicaloxygendemand) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltriethylammnoniumbromide) dATP:脱氧腺苷三磷酸(Deoxyadenosinetriphosphate) dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(Deoxyguanosinetriphosphate) DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) DMF:二甲基酰胺(N,N-Dimethylformamide) EDTA:乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetraaceticAcid) GYT:甘油酵母膏蛋白胨培养基(Glycerolyeastextracttryptonemedium) IPTG:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside) LB:肉汤培养基(Luria-bertani) OD:光密度(Opticaldensity) PFGE:脉冲场凝胶电泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis) PDA:马铃薯葡萄糖培养基(Potatodextroseagar) RNaseA:核糖核酸酶A(RNAaseA) SDS:十二烷基硫酸钠(Dodecylsulfate,sodiumsalt) SOC:含分解代谢抑制物的超级肉汤培养基(Superoptimalbrothwithcataboliterepression) Tris:三羟甲基氨基甲烷(2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) TE:Tris-HCl和EDTA-Na2配成的缓冲液 TBE:Tris-HCl、硼酸和EDTA-Na2配成的缓冲液 X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside) YPD:酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基(Yeastextractpeptonedextrosemedium) λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ:经EcoRⅠ酶(4.1)和HindⅢ酶(4.2)两种核酸内切酶消化后的λ噬 菌体DNA 4 试剂和材料* 4.1 EcoRⅠ酶。 4.2 HindⅢ酶。 4.3 BamHⅠ酶。 * 除非另有说明,在操作中仅使用分析纯试剂和电阻率大于18MΩ·cm的超纯水。 2GB/T30744—2014 4.4 SalⅠ酶。 4.5 Sau3AⅠ酶。 4.6 Klenow酶。 4.7 琼脂糖酶。 4.8 液体石蜡。 4.9 dATP(市售)。 4.10 dGTP(市售)。 4.11 琼脂糖凝胶:10g琼脂糖,缓慢加入1L水中,混匀,配制成10g/L的琼脂糖凝胶。 4.12 低熔点琼脂糖凝胶:10g低熔点琼脂糖,缓慢加入1L水中,混匀,配制成10g/L的低熔点琼脂 糖凝胶。 4.13 人工海水,按照GB/T12763.4的规定配制。 4.14 乙醇溶液:用水配制750mL/L(体积百分数为75%)的乙醇溶液。 4.15 稀酸溶液:量取83mL分析纯