ICS65.120 B46 中华人民共和国国家标准 GB/T30956—2014 饲 料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 Determinationofdeoxynivalenolinfeeds—Highperformance liquidchromatographywithimmunoaffinitycolumnclean-up 2014-07-08发布 2015-01-10实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。 本标准由农业部饲料质量监督检验测试中心(南昌)、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研 究所[国家饲料质量监督检验中心(北京)]、上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所、上海 市饲料质量监督检验站负责起草。 本标准主要起草人:文虹、饶辉、周华娇、符金华、尹腾桂、徐田放、饶正华、杨琳芬、邢磊、赵薇娜、 赵志辉。 ⅠGB/T30956—2014 饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)免疫亲和柱净化-高效液相色谱测定方法。 本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的测定。 本标准定量限为0.1mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇用水提取后,提取液经免疫亲和柱净化、浓缩后,用配有紫外检测器 或二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行测定,外标法定量。 4 试剂 除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T6682规定的二级水。 4.1 甲醇:色谱级。 4.2 乙腈:色谱级。 4.3 聚乙二醇(polyethyleneglycol,M=8000)。 4.4 HPLC流动相:量取100mL乙腈(4.2)至1000mL的容量瓶中,加入水定容至1000mL。混合 均匀并通过0.45μm滤膜,备用。 4.5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol)标准品:纯度≥98%。 4.6 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准储备液:准确称取适量的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品,用甲醇(4.1)配成 浓度为0.1mg/mL的标准储备液,贮于-20℃冰箱保存,可使用3个月。 4.7 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液:脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准储备液(4.6)用流动相(4.4)稀释,配制 0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL浓度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液储藏在2℃~8℃冰箱里,可使用7天。 5 仪器和设备 除实验室常用设备外,还需要以下仪器和设备: 1GB/T30956—2014 5.1 免疫亲和柱,柱容量≥1.25mg,回收率≥85%。 5.2 振荡器。 5.3 氮吹仪。 5.4 高速均质器:18000r/min~22000r/min。 5.5 高效液相色谱仪,配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.6 真空装置或空气压力泵,符合免疫亲和柱的要求。 5.7 玻璃纤维滤纸,直径21mm、125mm。 6 试样的制备 按GB/T14699.1采集有代表性的样品,按GB/T20195进行样品制备。粉碎过1mm孔筛,混合 均匀,装入密闭容器,低温保存备用。 7 分析步骤 7.1 提取 称取粉碎试样约50g(精确到0.1g)置于250mL具塞锥形瓶中,加入10g聚乙二醇(4.3)及 200mL水,高速均质(5.4)2min,或振荡器(5.2)振荡60min。静置,通过快速定性滤纸过滤,以玻璃纤 维滤纸(5.7)过滤1~2次,至滤液澄清,随即进行免疫亲和柱净化操作。 7.2 净化 将免疫亲和柱(5.1)连接于10mL玻璃定量管下。准确移取1mL澄清提取滤液(7.1)注入玻璃定 量管中,将空气压力泵(5.6)与玻璃定量管连接,调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓慢通过免 疫亲和柱,直至有部分空气通过柱体。以5mL水清洗柱子1次,弃去全部流出液,并使3mL以上空气 通过柱体。准确加入1mL甲醇(4.1)洗脱,流速不超过1mL/min,收集洗脱液于玻璃试管中,再用氮 吹仪(5.3)于50℃以下吹干。用0.5mL流动相(4.4)溶解残渣,涡旋混匀,过0.45μm滤膜,供液相色 谱测定。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱测定参考条件 色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,填料直径5μm或相当者; 流动相:见4.4; 流速:0.8mL/min; 检测波长:218nm; 进样量:20μL; 柱温:室温。 7.3.2 色谱测定 分别取试样溶液和标准工作液各20μL(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行测定,以标准工作 液浓度为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,绘制标准工作曲线,以保留时间定性,用标准工作曲线对试 样进行定量。脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液色谱图参见附录A。 2GB/T30956—2014 8 结果计算与表示 8.1 结果计算 试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量,以质量分数X计,单位为毫克每千克(mg/kg),按式(1)计算: X=c×V m×n …………………………(1) 式中: c———试样溶液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量,单位为微克每毫升(μg/mL); V———上机液的定容液体积,单位为毫升(mL); m———试样称取量,单位为克(g); n———稀释倍数。 8.2 结果表示 测定结果用平行测定的算术平均值表示,计算结果表示到小数点后一位。 9 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。GB/T30956—2014 GB/T30956—2014 附 录 A (资料性附录) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的标准品色谱图 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的标准品色谱图见图A.1。 图A.1 2mg/kg脱氧雪腐镰刀菌烯醇的标准溶液液相色谱图 4102 — 65903T / BG