ICS07.080 B30 中华人民共和国国家标准 GB/T30988—2014 多酚类植物基因组DNA提取纯化 及测试方法 MethodsofgenomicDNAextractionfromplantswithhighlevelsofpolyphenols 2014-07-24发布 2015-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 缩略语 1 …………………………………………………………………………………………………… 4 原理 1 ……………………………………………………………………………………………………… 5 实验室通用要求 2 ………………………………………………………………………………………… 6 试剂与溶液 2 ……………………………………………………………………………………………… 7 仪器和设备 2 ……………………………………………………………………………………………… 8 提取步骤 3 ………………………………………………………………………………………………… 9 DNA纯度、浓度测试 4 …………………………………………………………………………………… ⅠGB/T30988—2014 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国测试技术研究院提出。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)归口。 本标准起草单位:中国测试技术研究院、中测测试科技有限公司。 本标准主要起草人:谭和平、沈兴中、唐祥凯、周李华、孙登峰。 ⅢGB/T30988—2014 多酚类植物基因组DNA提取纯化 及测试方法 1 范围 本标准规定了以茶树为代表的多酚类植物基因组DNA提取纯化方法以及DNA纯度、浓度测试 方法。 本标准适用于茶树、马铃薯、樱桃、葡萄以及其他富含多酚类的植物的植物基因组DNA提取及 纯化。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682—2008 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T19495.3—2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Tris:三(羟甲基)氨基甲烷 SDS:十二烷基磺酸钠 PVP:聚乙烯吡咯烷酮 RNaseA:核糖核酸酶A FF:二甲苯青 EDTA:乙二胺四乙酸 TE:三(羟甲基)氨基甲烷–乙二胺四乙酸 4 原理 4.1 提取纯化 在液氮条件中,通过物理研磨方法破碎多酚类植物叶片的细胞,利用抗氧化剂防止多酚类化合物氧 化褐变,同时利用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的粘接性去除多酚类化合物及其他次生代谢物等杂质,然后利 用化学方法使DNA从植物细胞中释放出来,再弃除DNA中的蛋白质等杂质,以及DNA提取过程中 加入的异戊醇、异丙醇、乙醇等有机溶剂,最后得到纯的DNA。 4.2 纯度测试 在pH7~8.5下,根据DNA在260nm处有吸收高峰,蛋白质在280nm处有吸收高峰,硫氰酸盐、 碳水化合物(糖类)在230nm处有吸收高峰,酚类物质在270nm处有吸收高峰的特性,利用A260/A280、 1GB/T30988—2014 A260/A230、A260/A270的比值来评估DNA样品的纯度。然后利用A260=1相当于50μg/mL的双链 DNA来计算DNA的浓度。 利用荧光染料(如溴化乙啶)可与琼脂糖凝胶中的DNA嵌合,在紫外源激发下发出荧光的特性,通 过观察DNA条带是否单一、清晰、明亮来评估DNA样品的纯度。 5 实验室通用要求 按照GB/T19495.3—2004第4章中实验室通用要求的规定执行。 6 试剂与溶液 6.1 本标准所使用的水均为一级水,符合GB/T6682—2008的要求。除非另有说明,在分析中仅使用 分析纯试剂,所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后经高压灭菌后使用,不宜高压灭菌的试剂应用 0.22μm膜过滤除菌;酶溶液应避免反复冻融。 6.2 葡萄糖(glucose,C6H12O6)。 6.3 焦亚硫酸钠(sodiumpyrosulfite,Na2S2O5)。 6.4 聚乙烯吡咯烷酮[polyvinylpyrrolidone,PVP,(C6H9NO)n]。 6.5 β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,HOCH2CH2SH)。 6.6 十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS,C12H25O4SN)。 6.7 乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt,Na2EDTA,C10H14N2O8Na2)。 6.8 三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)methylaminomethane,Tris,C4H11NO3]。 6.9 无水乙醇(alcohol,C2H5OH),4℃保存及使用。 6.10 氯化钠(sodiumchloride,NaCl)。 6.11 三氯甲烷(chloroform,CHCl3)。 6.12 异丙醇[isopropylalcohol,CH3CH(OH)CH3]。 6.13 异戊醇[isoamylalcohol,(CH3)2CHCH2CH2OH]。 6.14 乙酸钠(sodiumacetate,NaAc)溶液:3mol/L,用乙酸调pH至5.2,不要高压灭菌(0.22μm膜过 滤)。 6.15 氯仿∶异戊醇∶乙醇溶液(80∶4∶16)。 6.16 DNA提取液Ⅰ:100mmol/LTris-Cl,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。 6.17 DNA提取液Ⅱ:18.6g葡萄糖,6.9gNa2S2O5,6.0gPVP,240μLβ-巯基乙醇,加水至300mL。 6.18 TE缓冲液(pH8.0):10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA,使用HCl或NaOH调节pH。 6.19 RNaseA酶溶液:10mg/mL,-20℃保存,避免反复冻融。 6.20 70%乙醇溶液:4℃保存及使用。 6.21 10×上样缓冲液:含0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油水溶液。 7 仪器和设备 7.1 冷冻研磨机(样品冷冻,研磨都处于液氮条件下)。 7.2 离心机(可以在4℃下进行离心,离心转速10000r/min以上)。 7.3 水浴锅(工作范围60℃~70℃)。 7.4 涡旋器。 7.5 平板电泳仪。 2GB/T30988—2014 7.6 凝胶成像系统。 7.7 可调移液器(0.5μL~10μL,10μL~1000μL,100μL~1000μL,0.5mL~5mL)。 7.8 紫外分光光度计。 7.9 天平(精度为0.1mg)。 8 提取步骤 多酚类植物基因组DNA提取按下述步骤进行: a) 取植物新鲜嫩叶,用无菌超纯水冲洗1min,70%乙醇消毒2min,最后用无菌超纯水冲洗 2min,无菌吸水纸吸干水分,称取约0.5g(精确至0.1mg)。 b) 将干净的样品放于灭菌的样品研磨瓶中,按表1研磨机研磨条件将样品研磨成粉状,迅速用无 菌玻棒将磨碎的样品转移至预冷的含有5mLDNA提取液Ⅱ的15mL离心管中,加入0.09g Na2S2O5,0.2gPVP,500μLβ-巯基乙醇,颠倒混匀,于4℃下以5000r/min离心5min。 表1 研磨机研磨条件 步骤 时间 预冷 2min 研磨 1min 频率 12次/s c) 去上清液,加入5mL预热至65℃的DNA提取液Ⅰ,温和颠倒混匀,65℃温浴1h,温浴期间 每10min摇动混匀一次。 d)将离心管放置于冰上冷却,加入1mL预冷的NaAc溶液。 e)混匀后加入5mL氯仿∶异戊醇∶乙醇溶液,温和颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),冰上 静置5min~10min,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。在4℃下以10000r/min离 心10min,仔细移取上清液至一无菌15mL离心管中,重复该步骤。 f)向抽提得到的上清液中加入等体积异丙醇,温和倒转数次使之混匀,-20℃放置20min,出现 絮状DNA沉淀。 g)将絮状DNA沉淀转入含600μLTE的无菌离心管中(如DNA不形成絮状沉淀,则可在4℃ 下以10000r/min离心5min,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE, 可在60℃水浴放置15min以上,以帮助溶解)。 h)加入RNaseA溶液至RNaseA终浓度为10μg/mL,37℃温浴30min;加入0.1gPVP,加入 等体积的氯仿∶异戊醇∶乙醇溶液,温和颠倒混匀,10000r/min离心10min。 i)取上清液于1.5mL灭菌离心管内,重复抽提一次。 j)向抽提得到的上清液中加入1/10体积的NaAc溶液,加入2倍体积预冷的无水乙醇,混匀, -20℃放置20min左右。 k)在4℃下以10000r/min离心10min,弃上清液,加入1mL70%乙醇,温和颠倒离心管数次, 洗涤沉淀,重复该步骤2次。 l)向沉淀加入500μL预冷的无水乙醇,在4℃下以10000r