ICS65.020.30 B43 中华人民共和国国家标准 GB/T31581—2015 牛性控冷冻精液生产技术规程 Codeofpraticeonproductionofbovinefrozensexed-semen 2015-05-15发布 2015-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。 本标准起草单位:农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(北京)、内蒙古赛科星繁育生物技术股 份有限公司、北京奶牛中心、中国农业大学、全国畜牧总站、农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心 (南京)。 本标准主要起草人:张晓霞、李喜和、周文忠、刘海良、孙飞舟、张胜利、陆汉希、杨清峰、武玉波、 钱松晋、张海涛、刘玉、赵鹏、王建国、胡树香、张勇、胡志刚。 ⅠGB/T31581—2015 牛性控冷冻精液生产技术规程 1 范围 本标准规定了牛性控冷冻精液生产的器械清洗和消毒、稀释液配制、采精、精液处理、精子分离、冷 冻、解冻、检验、包装、贮存及运输。 本标准适用于采用流式细胞分离技术生产牛性控冷冻精液。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB4143 牛冷冻精液 GB/T5458 液氮生物容器 GB/T31582 牛性控冷冻精液 NY/T1234 牛冷冻精液生产技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 精子分离 spermsorting 根据X精子和Y精子DNA含量的差异,利用流式细胞分离方法将X精子和Y精子分离开。 3.2 性控冷冻精液 frozensexed-semen 分离后富含X精子或Y精子、经超低温冷冻后在液氮中长期保存的精液。 4 采精用品清洗和消毒 按照NY/T1234的规定执行。 5 溶液配制与灭菌 5.1 溶液配制 5.1.1 稀释液 稀释液配制见附录A中A.1。 5.1.2 分离机缓冲液Tris-sheath 分离机缓冲液Tris-sheath的配制见A.2。 1GB/T31581—2015 5.1.3 荧光染色液和食品红染色液 荧光染色液和食品红染色液配制见A.3。 5.1.4 精子染色液 精子染色液的配制见A.4。 5.1.5 精子收集液 精子收集液配制见A.5。 5.2 溶液灭菌 溶液在使用前进行高压蒸汽灭菌(120kPa,15min),对于不能高压灭菌的溶液使用0.22μm过滤 器进行过滤除菌。 6 主要仪器设备 流式细胞仪、精液分装机、细管印字机、程序冷冻仪、荧光显微镜、离心机、精子密度仪。 7 采精 按照NY/T1234的规定执行。 8 精液处理 精液处理方法按照NY/T1234的规定执行,精液分离前应添加抗生素并在18℃~20℃的环境下 保存,储存时间不超过16h。 9 精子分离 9.1 分离环境 精子分离实验室应保持洁净,室温控制在18℃~25℃,无振动源。 9.2 分离前处理 根据所采原精密度,按比例进行染色。 示例:对4亿个精子进行染色,用染色原液稀释到2亿个/mL,加入15μL~30μLHochest33342荧光染色液放入 5mL分离专用试管,混匀后放入34℃水浴,加盖避光温育45min。再加入2mL含4%卵黄的食品红染色液,最后制成 精子分离样品。 9.3 分离 按照分离机操作规程分离。 2GB/T31581—2015 10 分离精液冷冻 10.1 稀释平衡 分离后的精液在4℃±1℃条件下平衡90min后同温1750g离心5min,去除上清液。然后用 20%卵黄Tris-A液稀释收集后的分离精液,使精子密度≥2000万个/mL。之后添加等量的含12%甘 油的Tris-B液,平衡20min。用1∶1的Tris-A液、Tris-B液将最终精子密度调整为 ≥1000万个/mL。 10.2 分装 平衡后的精液在4℃±1℃条件下灌装、封口、印字,在细管上打印生产单位代号、品种、牛号、生产 日期或批号(见附录B)、性控标记等信息。 10.3 冷冻、包装 在4℃±1℃条件下将分装后的细管按照棉塞同一方向码放在冷冻架上,然后移入冷冻仪中,冷冻 的初冻温度调节至-90℃,控制降温过程,在20min到达-120℃后投入液氮中。冷冻结束后进行包 装,包装应在-140℃以下进行。保存性控冷冻精液的液氮生物容器应符合GB/T5458的规定。 11 入库前检查 性控冷冻精液产品的质量应由专职的质量检验员负责检测,每批性控冷冻精液入库前应进行常规 检验,方法见GB/T31582。检验合格后方可入库。 12 贮存、运输 按照NY/T1234的规定执行。 3GB/T31581—2015 附 录 A (规范性附录) 牛性控冷冻精液生产相关溶液配制 A.1 溶液配制 试剂纯度应达到分析纯。 A.1.1 Tris-A工作液 取TrizmaBase35.32g、柠檬酸17.21g、D-果糖12.65g溶于750mL双蒸水,搅拌30min,再加入 双蒸水至1000mL。溶液pH调到6.8,然后用0.22μm的过滤器过滤除菌,5℃±1℃保存,有效期 14d。 A.1.2 20%卵黄Tris-A液 取Tris-A工作液199mL,添加51mL卵黄液,搅拌15min,5℃±1℃静置12h,去除沉淀,吸出 表层卵脂后,在18500g的条件下离心。然后用0.22μm的过滤器过滤除菌,加入抗生素,5℃±1℃保 存,有效期7d。 A.1.3 Tris-B工作液 取TrizmaBase35.746g、柠檬酸19.980g、D-果糖14.712g溶于750mL双蒸水,搅拌30min,再 加入双蒸水至1000mL。溶液pH调到6.8,然后用0.22μm的过滤器过滤除菌,5℃±1℃保存,有效 期14d。 A.1.4 12%甘油Tris-B液 先用Tris-B工作液配制23%(体积分数)卵黄液,搅拌15min后置5℃±1℃条件下12h析出沉 淀。静置后吸出表层卵脂,并在18500g的条件下进一步离心沉淀。然后用0.22μm的过滤器过滤除 菌。再加入甘油使甘油终浓度达到12%(体积分数)。溶液pH调到6.8,加入抗生素,在5℃±1℃保 存,有效期7d。 A.2 分离机缓冲液Tris-sheath配制 配制20LTris-sheath工作液:取TrizmaBase477.6g、柠檬酸232.6g、D-果糖171.0g溶于3.0L 双蒸水中搅拌30min,并加盐酸把pH调到6.8,然后添加抗生素用0.22μm的过滤器过滤灭菌,再加双 蒸水至20.0L容量,调节pH至6.8,渗透压290mOsm±10mOsm。在5℃±1℃保存,有效期14d。 A.3 荧光染色液和食品红染色液配制 A.3.1 0.5%荧光染色液 将10mg荧光染料Hochest33342定容于2mL双蒸水中,在5℃±1℃条件下避光保存,有效期 90d。 4GB/T31581—2015 A.3.2 5%食品红染色液 将0.5g食品红染料定溶于10mL双蒸水中,0.22μm过滤除菌,在5℃±1℃条件下避光保存。 有效期为90d。 A.4 精子染色液配制 A.4.1 精子染色原液 100mL精子染色原液:依次称取HEPES0.925g、氯化镁(MgCl2·6H2O)0.008g、氯化钠(NaCl) 0.5518g、氯化钾(KCl)0.0224g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.004g、碳酸氢钠(NaHCO3)0.084g、丙酮酸 钠0.022g、葡萄糖0.09g、乳酸钠0.361mL、BSA0.3g,溶于100mL双蒸水中,调整pH至7.4,加入 0.25mL庆大霉素(10mg/mL),0.22μm过滤灭菌后,在5℃±1℃保存,有效期为7d~10d。 A.4.2 含4%卵黄的食品红染色液 A.4.1中100mL精子染色原液,加入0.261mL食品红染色液,形成食品红染色液。取96mL食 品红染色液添加4mL卵黄,搅拌后在5℃条件下静置12h。去除卵黄颗粒沉淀,18500g离心30min, 调整pH至5.5,然后加入0.25mL庆大霉素(10mg/mL),经过0.22μm过滤灭菌,在5℃±1℃保存, 使用期限为14d。 A.5 精子收集液配制 取20%卵黄Tris-A液100mL,加入16mL双蒸水,充分摇匀。5℃±1℃保存,有效期7d。 5GB/T31581—2015 附 录 B (规范性附录) 细管性控冷冻精液标记方法 细管性控冷冻精液标记由20个字符、5个部分组成,每部分之间空开2个字符位置,排列顺序 如下: 第一部分 第二部分 第三部分 第四部分 第五部分 生产单位代号品种代号 公牛注册号 生产日期 性控标记 三个字符 二个字符 五个字符 六个字符 四个字符 第一部分公牛站代号以农业部公布的公牛站代号为准(参照NY/T1234标准执行);第二部分品种 代号以GB4143为依据;第三部分公牛号取该牛身份证号码的后五位数;第四部分冻精生产日期六位 数按年、月、日次序排列,年、月、日各占二位数;第五部分性控标记:性控或XK,X为雌性,Y为雄性。 每部分之间间隔2个字符位置。标记的字迹应清晰易认。 示例: ×××为生产单位代号,HS为荷斯坦公牛的品种代号,×××××为该公牛身