ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31797—2015 啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofHoplatentviroid 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫 局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中国农业科学研究院植物保护研究所、石河子大学。 本标准主要起草人:郭立新、邓丛良、段维军、张祥林、李世访、姜冬梅、荣德福、刘升学。 ⅠGB/T31797—2015 啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于啤酒花(Humuluslupulus)及其无性繁殖材料、种子、花粉上啤酒花潜隐类病毒的检 疫鉴定,同时也适用于葎草(Humulusjaponicus)和异株荨麻(Urticadioica)上啤酒花潜隐类病毒的检 疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 仪器设备、主要用具和主要试剂 3.1 仪器设备 电子天平(感量0.001g)、普通天平(感量0.1g)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超 低温冰箱(-80℃)、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、可调移 液器(2.5μL,10μL,20μL,200μL,1000μL,5000μL)。 3.2 主要用具 无RNase吸头(10μL,20μL,200μL,1000μL,5000μL)、无RNase离心管(1.5mL,5mL, 10mL)、研钵、研棒、磁性分离架、PCR反应管(200μL)、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交 袋、X光片。 3.3 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。RT-PCR检测试 剂见附录B;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C;斑点杂交检测试剂见附录D。 4 检测样品制备 4.1 种子类 随机抽取至少50粒种子样品,进行表面消毒后,置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中,在适宜的发 芽温度条件下催芽,直至长出第一对真叶(发芽时间大约一周);或者在消毒的土壤中直接种植,直至长 出第一对真叶。取适量叶片,放入洁净的研钵中,加入液氮后迅速研磨成细粉状。 1GB/T31797—2015 4.2 种苗类 对于有症状的种苗类样品选取全部表现症状种苗类样品的叶片,对于无症状的种苗类样品选取适 量样品的叶片,放入洁净的研钵中,加液氮后迅速研磨成细粉状。 5 检测与鉴定 5.1 试验设计 每个样品设置两个平行反应。检测时以感染啤酒花潜隐类病毒的植物组织作为阳性对照,以健康 植物组织作为阴性对照,以双蒸水代替模板作为空白对照。 5.2 普通RT-PCR方法 普通RT-PCR方法见附录B。 5.3 实时荧光RT-PCR方法 实时荧光RT-PCR方法见附录C。 5.4 斑点杂交方法 斑点杂交方法见附录D。 6 结果判定 样品经普通RT-PCR检测为阳性,且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性,则判 定为检出啤酒花潜隐类病毒。 样品经普通RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的HpLVd序列一致,则判定为检出啤酒 花潜隐类病毒。 7 结果记录与样品保存 7.1 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,试验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员签字。普通RT-PCR检测结果保存电泳照片,实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图 及Ct值,斑点杂交检测保存照片,序列测定结果保存测序报告图。 7.2 样品保存与处理 样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月,种子保存在干燥条件下或4℃冰箱内,生长苗木保 存在隔离温室中,其他繁殖材料可取实验样品在-80℃冰箱内保存。对检出啤酒花潜隐类病毒的样品 应至少保存6个月,以备复检、谈判和仲裁。保存期满后,应灭活处理。 2GB/T31797—2015 附 录 A (资料性附录) 啤酒花潜隐类病毒相关资料 A.1 背景资料 A.1.1 啤酒花潜隐类病毒基本信息 学名:Hoplatentviroid。 缩写:HpLVd。 分类地位:马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)、椰子死亡类病毒属(Cocadviroid)。 A.1.2 方法原理 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光RT-PCR反应及斑点杂交方法是本标准制定的主要依据。 A.2 寄主范围 HpLVd寄主范围较窄,仅侵染啤酒花(Humuluslupulus)、葎草(Humulusjaponicus)和异株荨麻 (Urticadioica)。 A.3 病害症状 寄主受HpLVd侵染后一般不表现症状,但在英国,啤酒花Omega品种受HpLVd侵染后,出现萎 黄、生长缓慢及球果较小等症状。 A.4 分布地区 欧洲:比利时、捷克、英国、法国、德国、匈牙利、波兰、葡萄牙、俄罗斯、西班牙、南斯拉夫。 亚洲:日本、韩国、中国(新疆)。 美洲:巴西、美国。 非洲:南非。 大洋洲:澳大利亚。 A.5 传播方式 HpLVd主要通过无性繁殖材料、农事操作工具进行传播;也可通过种子(8%传毒率)、花粉传播, 但传毒率很低;至今尚无昆虫介体传播的报道。 A.6 基因组 HpLVd的基因组为一条环状单链RNA,长256nt,具有5个功能区,形成稳定的棒状二级结构。 HpLVd通过不对称滚环模式进行复制,基因组不编码蛋白质。 3GB/T31797—2015 附 录 B (规范性附录) 普通RT-PCR检测方法 B.1 主要试剂 B.1.1 1mol/L磷酸氢二钾(K2HPO4) 磷酸氢二钾 17.42g 加双蒸水定容至100mL。用0.22μm滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。 B.1.2 2.5mol/L磷酸氢二钾(K2HPO4) 磷酸氢二钾 43.55g 加双蒸水定容至100mL。用0.22μm滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。 B.1.3 3mol/L乙酸钠(NaAc)(pH5.2) 三水乙酸钠 40.83g 用3mol/L乙酸调节pH至5.2。用双蒸水定容至100mL。高压蒸汽灭菌。 B.1.4 4mol/L氯化锂(LiCl) 氯化锂 16.96g 加双蒸水定容至100mL。用0.22μm滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。贮存于4℃。 B.1.5 研磨缓冲液 异硫氰酸胍(GITC) 4mol/L 十二烷基肌氨酸钠 5g/L 曲拉通X-100(TritonX-100) 0.1%(体积分数) 氯化钠(NaCl) 10mmol/L 柠檬酸钠缓冲液(pH7.0) 25mmol/L 聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 20g/L B.1.6 50×TAE缓冲液 Tris碱 242g 冰乙酸 57.1mL 乙二胺四乙酸(EDTA)(0.5mol/L,pH8.0)100mL 加双蒸水定容到1L。 B.1.7 6×Loading缓冲液 溴酚兰 2.5g/L 二甲苯青FF 2.5g/L 蔗糖水溶液 400g/L 4GB/T31797—2015 贮存于4℃。 B.2 引物序列 正向引物HLVdF:5'-ATACAACTCTTGAGCGCCGA-3';反向引物HLVdR:5'-CCACCG GGTAGTTTCCAACT-3';扩增片段大小为256bp。 B.3 试验步骤 B.3.1 RNA的提取 B.3.1.1 方法一 B.3.1.1.1 取1g样品,加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移入10mL离心管中,并加入2mL1mol/L 磷酸氢二钾和8μL巯基乙醇,混匀,再加入2mL水饱和酚∶三氯甲烷(体积比1∶1),充分混匀;4℃, 10000g离心10min。 B.3.1.1.2 取上层液体,加入同体积的水饱和酚∶三氯甲烷(体积比1∶1),充分混匀;4℃,10000g离 心10min。 B.3.1.1.3 取上层液体,加入2.5倍体积的无水乙醇,充分混匀;-20℃下放置2h~4h或-80℃下放 置至少30min;4℃,10000g离心10min。 B.3.1.1.4 取沉淀,加1mL无RNase的水充分溶解后,再加入1mL2.5mol/L磷酸氢二钾、1mL的 乙二醇单甲醚(即:2-甲氧基-乙醇),充分混匀;4℃,10000g离心10min。 B.3.1.1.5 取上层液体,加入无RNase的水至10mL,再加入100μL20g/L的十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)溶液,充分混匀,冰浴3h~4h;4℃,10000g离心10min。 B.3.1.1.6 取沉淀,加入2mL无RNase的水充分溶解后,加入5mL无水乙醇、0.2mL3mol/L乙酸 钠(pH5.2),充分混匀,-20℃下放置至少2h;4℃,10000g离心10min。 B.3.1.1.7 取沉淀,加200μL无RNase的水反复吹打,待沉淀充分溶解后,将溶解物移入1.5mL离心 管中;加入200μL4mol/L氯化锂,充分混