ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31800—2015 李痘病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPlumpoxvirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:陈先锋、张慧丽、陈定虎、张吉红、徐瑛、郭立新、闻伟刚、杨红霞、杜洪忠、吴品珊。 ⅠGB/T31800—2015 李痘病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了李痘病毒的免疫学和分子生物学检疫鉴定方法。 本标准适用于植物材料,包括无性繁殖材料、组培苗、种子、花和果实中李痘病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析试验室用水规格和试验方法 SN/T1840 植物病毒免疫电镜检测方法 3 仪器设备和主要试剂 3.1 仪器设备 普通PCR仪、实时荧光PCR仪、酶标仪、电子天平(1/1000g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水 浴锅、台式高速冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡 器。可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNase吸头、无 RNase离心管、PCR管和研钵等。 3.2 主要试剂 除特别规定外,所有实验用试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 Trizol、焦碳酸二乙酯(DEPC)、液氮、三氯甲烷、异丙醇、乙醇、β-巯基乙醇、RNA反转录酶、 TaqDNA聚合酶、SYBRgreenI、DNA相对分子质量标准物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。双抗体酶 联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)检测试剂配制方法见附录B中B.1。 4 检疫鉴定方法 4.1 症状检查 仔细检查植株的叶片及花、果实、果核是否有褪色、环斑、畸形等可疑症状,如果出现了典型症状(参 见附录A),可采集表现症状的花、叶片或果实进行后续检测。 4.2 双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA) DAS-ELISA具体操作步骤见附录B。 4.3 普通RT-PCR检测方法 普通RT-PCR检测方法具体操作步骤见附录C。 1GB/T31800—2015 4.4 实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-PCR检测方法具体操作步骤见附录D。 4.5 免疫电子显微镜观察 按SN/T1840执行。 4.6 株系鉴定 在检出李痘病毒时,必要时可对其进行株系鉴定,株系鉴定的具体操作步骤见附录E。 5 结果判定 采用DAS-ELISA进行初筛,测定结果为阴性,判定未检出李痘病毒;测定结果为阳性,用普通 RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法进行验证,当验证结果也为阳性时,则判定检出李痘病毒。若需 进一步鉴定该病毒,可采用免疫电子显微镜观察或PCR产物序列测定等进行复验。 6 样品保存与结果记录 6.1 样品保存 经检验确定携带李痘病毒的样品,经登记和标记后保存在-20℃冰箱中,有条件的保存在-80℃ 冰箱中,妥善保存6个月,以备复核。 6.2 结果记录 需要保存的记录包括:样品的种类、自然状态、来源、为害症状及为害程度(无症状也要说明),诊断 时使用的方法(包括质控物质,以及每种方法获得的结果),酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的 数值,RT-PCR检测应有电泳结果照片,实时荧光RT-PCR应有扩增曲线图片,鉴定实验室的名称,负 责人和鉴定人的签字等。 2GB/T31800—2015 附 录 A (资料性附录) 李痘病毒相关信息 A.1 李痘病毒基本信息 中文名:李痘病毒 学名:Plumpoxvirus 异名:Sharkavirus 缩写:PPV 分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae),马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。 A.2 方法原理 李痘病毒为害症状、血清学特性和基因组特征是制定本标准的主要依据。根据李痘病毒免疫原性 强,可以制备病毒抗血清和外壳蛋白基因保守性强,可以设计特异性引物和探针。采用双抗体夹心酶联 免疫吸附反应和逆转录-聚合酶链式反应以及序列测定作为该病毒的检疫鉴定依据。 A.3 寄主范围 PPV能侵染木本科和草本科寄主,自然条件下,PPV很容易侵染李属植物:杏(Prunus armeniaca)、桃(P.persica)、油桃(P.persicavar.nectarina)、欧洲李(P.domestica)、李(P.salicina)、乌荆 子李(P.insititia)、樱桃李(P.cerasifera)、麦李(P.glandulosa)、甜樱桃(P.avium)、欧洲酸樱桃 (P.cerasus)。野生的李属寄主:扁桃(P.amygdalus)、杏(P.americana)、西沙樱桃(P.bessey)、马哈 利樱桃(P.mahaleb)、梅(P.mume)、矮樱桃(P.pumila)、郝图兰李(P.hortulana)、山桃(P.davi- dana)、毛樱桃(P.tomentosa)、紫杏(P.nigra)、滨梅(P.maritime)、桂樱(P.laurocerasus)。 A.4 病害症状 PPV在植株的叶片、花瓣、果实和果核都可能引起症状。 叶片:叶上症状特别清晰,出现带状或环状褪绿斑,明脉甚至畸形,见图A.1a、b、c。 花瓣:引起花瓣褪色,见图A.1d。 果实:果皮上出现褪绿或环斑,见图A.1e、f、g。果实受害后有时会变形,呈不规则状并在其褪色 环内形成褐色或坏死区域,果实内部变褐见图A.1i。 果核:染病的果核上产生浅色的环斑,见图A.1h。 3GB/T31800—2015 说明: a———杏叶上的典型症状,带状和环状褪绿斑; b———桃叶上引起明脉; c———李子叶片上的症状; d———PPV-M引起桃花花瓣褪色; e———PPV-D在桃果实上引起的症状,浅黄色环; f———PPV-M在桃果实上引起的症状,果皮上出现浅黄色环或线状纹; g、h———PPV在杏果实上引起的症状,果皮上出现浅黄色环,果核上产生浅色的环; i———李果实上的症状。 注:a~h引自BulletinOEPP/EPPOBulletin34,247~256,i引自http://www.forestryimages.org/browse/detail. cfm?imgnum=0660082。 图A.1 PPV在寄主植物上的为害症状 A.5 地理分布 欧洲:波斯尼亚和黑塞哥违亚、保加利亚、罗马尼亚、塞尔维亚、克罗地亚、捷克共和国、波兰、匈牙 利、摩尔多瓦、斯洛伐克、斯洛文尼亚、乌克兰、阿尔巴尼亚、希腊、意大利、葡萄牙、西班牙、比利时、法国、 卢森堡、奥地利、德国、英国、俄罗斯、挪威、前南斯拉夫、亚速尔群岛、立陶宛、荷兰和瑞士; 亚洲:塞浦路斯、印度、叙利亚、土耳其; 非洲:埃及; 北美洲:美国、加拿大; 南美洲:智利; 大洋洲:澳大利亚。 A.6 传播途径 近距离通过昆虫介体进行传播,PPV至少可以通过20种蚜虫作非持久性传播,其中较重要的有: 蓟短尾蚜(Brachycaudus)、桃短尾蚜(B.helichrysi)、忽布疣额蚜(Phorodonhumuli)和桃蚜(Myzus 4GB/T31800—2015 persicae)。次要的昆虫介体有:蚜属一种(Aphisarbuti)、花生蚜(A.craccivora)、黑豆蚜(A.fabae)、 棉蚜(A.gossypii)、蚜属一种(A.hederae)、绣线菊蚜(A.spiraecola)、飞廉短尾蚜(Brachycaudus cardui)、李短尾蚜(B.persicae)、玫瑰苹果蚜(Dysaphisplantaginea)、西圆尾蚜(D.pyri)、桃粉蚜 (Hyalopteruspruni)、蔷薇长管蚜(Macrosiphumrosae)、黄荊蚜属一种(Megourarosae)、桃卷叶蚜 (M.varians)、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphumpadi)、悬钩子长管蚜(Sitobionfragariae)、苣荬指管蚜 (Ureleuconsonchi),并易经汁液接种传播。 远距离主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运。 A.7 粒体形态 病毒粒体线状,长约700nm,直径约11nm。 注:引自MBoulila2004,放大40000倍。 图A.2 李痘病毒粒体形态 A.8 基因组特征 PPV基因组为单分体基因组,基因组含一条正单链RNA,该RNA分子由近10000个核苷酸组 成,并包被在由多达2000个亚基构成的单一外壳蛋白中。 A.9 血清学特性 根据血清学特性和分子生物学特性,PPV的分离物目前分为7个型:D(Dideron)型、M(Marcus) 型、C(Cherry)型、EA(ElAmar)型、W(Winona)型、Rec(Recombinant)型和T(Turkey)型等。绝大多数 PPV的分离物均属于D型和M型。Rec型是D型和M型的重组型,Rec型血清学特性与M型相似。 5GB/T31800—2015 附 录 B