ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31803—2015 棉花皱叶病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofCottonleafcrumplevirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、浙江大学、浙 江出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:张永江、雷荣、沈建国、周雪平、鲁洁、张明哲、李桂芬、朱水芳。 ⅠGB/T31803—2015 棉花皱叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了棉花皱叶病毒的免疫学及分子生物学检疫鉴定等方法。 本标准适用于可能携带棉花皱叶病毒的活体寄主植物叶片组织的检疫鉴定。 2 仪器设备、用具和试剂 2.1 仪器设备 电子分析天平(0.001g)、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪、实时荧 光PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、 制冰机、涡旋振荡器、微波炉等。 2.2 用具 可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL)、吸头、离心管、Eppendorf管(0.2mL、 0.5mL、1.5mL)和研钵等。 2.3 试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。 DAS-ELISA、常规PCR及实时荧光PCR检测试剂分别见附录B、附录C及附录D。 3 检疫鉴定方法 3.1 DAS-ELISA检测 DAS-ELISA检测见附录B。 3.2 常规PCR检测 常规PCR检测见附录C。 3.3 实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测见附录D。 4 结果判断 3.1、3.2及3.3中两种不同原理的检测方法的结果为阳性,即可判定样品为CLCrV阳性。一般是 DAS-ELISA检测为阳性后,常规PCR或实时荧光PCR检测结果为阳性即可判断样品为CLCrV阳性。 1GB/T31803—2015 5 样品保存与记录结果 5.1 样品保存 结果判定为阳性的样品应妥善保存,并做好登记和标记,以备复核用。保存期满后,需经灭活处理。 5.2 结果记录 完整的实验记录要包括:样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果,并有实验人员 的签字;DAS-ELISA检测需有酶联反应原始数据,PCR检测需有电泳结果图片,实时荧光PCR检测需 有扩增曲线结果图片。 2GB/T31803—2015 附 录 A (资料性附录) 棉花皱叶病毒背景资料 A.1 背景资料 A.1.1 棉花皱叶病毒基本信息 中文名:棉花皱叶病毒。 学名:Cottonleafcrumplevirus。 缩写:CLCrV。 分类地位:双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。 传播途径:烟粉虱(Bemisiatabaci)及苗木嫁接传播,机械接触、菟丝子(Cuscutasubinclusa)、种子 及花粉不传播。 A.1.2 方法原理 根据棉花皱叶病毒与抗体之间的特异性反应,对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA) 检测;根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测,通过电泳条带大小或扩 增曲线的变化进行结果判定。 A.2 寄主范围 包括棉属(Gossypium)、苘麻属(Abutilon)、蜀葵属(Althaea)、木槿属(Hibiscus)、锦葵属(Malva)、栗豆 树属(Castanospermum)、大豆属(Glycine)、菜豆属(Phaseolus)及巢菜属(Vicia)的一些植物。 A.3 分布 该病毒主要分布在印度、墨西哥、美国、危地马拉及中东地区。 A.4 病害症状 该病毒侵染棉花造成叶中脉组织增生、叶脉坏死或脉明,叶脉组织的叶肉部分偶尔出现红色小点, 有时形成分散的泡斑;苞叶和花常畸形;叶柄弯曲,叶片向下卷曲并有明显的花叶。 A.5 粒体形态 病毒粒体双生,无包膜,直径为17nm~20nm,二聚体长30nm~32nm。 A.6 基因组特征 该病毒具有Begomovirus病毒典型的基因组,含有2条大小均为2.5kb~3.0kb的单链闭合环状 DNA分子,即DNA-A和DNA-B;二者是棉花皱叶系统感染必需的。A和B共同区(commenrigon, CR)的序列同源性相对较低。 3GB/T31803—2015 附 录 B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) B.1 试剂耗材 B.1.1 酶联板的要求 使用质量有保证厂商生产的酶联板。 B.1.2 包被抗体 特异性的棉花皱叶病毒抗体。 B.1.3 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的棉花皱叶病毒抗体。 B.1.4 底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP) B.1.5 10×PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl)80g、磷酸二氢钾(KH2PO4)2g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)11.5g、氯化钾(KCl)2g、 吐温-20(Tween-20)5mL,用盐酸(HCl)调pH至7.4,并定容至1000mL,4℃条件下贮存。 B.1.6 样品抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠(Na2SO3)1.3g、聚乙烯基吡咯烷酮(MW24000~40000,PVP)20g、叠氮化钠(NaN3) 0.2g、吐温-20(Tween-20)20mL,溶于800mL的1×PBST中,用盐酸(HCl)调pH至7.4,加1×PBST 定容至1000mL,4℃条件下贮存。 B.1.7 包被抗体缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g、叠氮化钠(NaN3)0.2g,用盐酸(HCl)调pH 至9.6,加水定容至1000mL,4℃条件下贮存。 B.1.8 洗涤缓冲液 将1×PBST缓冲液用HCl调pH至7.4,4℃条件下贮存。 B.1.9 酶标抗体缓冲液(pH7.4) 1×PBST缓冲液800mL、牛血清白蛋白(BSA)2g、聚乙烯基吡咯烷酮(MW24000~40000, PVP)20g、叠氮化钠(NaN3)0.2g,用1×PBST定容至1000mL,4℃条件下贮存。 B.1.10 底物(pNPP)缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺(C4H11NO2)97mL、叠氮化钠(NaN3)0.2g,用盐酸(HCl)调pH至9.8,用蒸馏水定容至 4GB/T31803—2015 1000mL,4℃条件下贮存。 B.1.11 底物(pNPP)溶液 将4-硝基酚磷酸钠盐(pNPP)100mg溶解于pNPP底物缓冲液100mL中,现配现用。 B.1.12 反应终止液 氢氧化钠(NaOH)40g,用蒸馏水定容至1000mL。 B.2 样品制备 取植物叶片组织0.2g~1.0g,按1∶5(g/mL)加入样品提取缓冲液,用研钵研磨样品,4000g离 心5min后吸取上清液待用。 B.3 操作步骤 B.3.1 包被抗体 根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上,包括2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照 孔和多个待检测样品孔,每个样品重复2次;每孔加入100μL的包被抗体溶液,封口膜包好,37℃孵育 2h~4h(或4℃冰箱过夜)。 B.3.2 加样 将酶联板孔中溶液控干,用PBST洗涤3次,每次3min,然后在滤纸上扣干;将100μL待测样品溶 液加入到待检测孔中,对照孔中也各加入100μL相应的对照。封口膜包好,37℃孵育2h~3h(或 4℃冰箱过夜)。 B.3.3 加酶标抗体 洗涤,步骤同B.3.2;用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体,每孔加入100μL酶标抗体溶 液,封口膜包好,37℃孵育2h~4h。 B.3.4 加底物 洗涤,步骤同B.3.2;每孔加入100μL底物溶液,室温孵育0.5h~2h。必要时每孔加入50μL的终 止液终止反应。 B.3.5 读数 酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。 B.4 结果判定 B.4.1 质量控制要求 空白对照孔和阴性对照孔OD405值<0.15;阳性对照OD405值/阴性对照OD405值>2;同一样品的 OD405值应基本一致。 5GB/T31803—2015 B.4.2 结果判定 若满足不了B.4.1的质量要求,则不能进行结果判定。 在满足了B.4.1的质量要求后,则按如下原则作出判定: ———样品OD405值/阴性对照OD405值明显大于2,结果判定为阳性; ———样品OD405值/阴性对照OD405值在阈值附近,判为可疑样品,需重做一次或者用3.2或3.3方 法进行验证; ———样品OD405值/阴性对照OD405值明显小于2,判为阴性。 6GB/T31803—2015