ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31806—2015 马铃薯V病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPotatovirusV 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:李桂芬、李旻、马洁、鲁洁、张永江、孔君、魏梅生。 ⅠGB/T31806—2015 马铃薯V病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了植物检疫中马铃薯V病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于马铃薯块茎、组培苗等繁殖材料中马铃薯V病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 仪器设备及试剂 3.1 仪器设备 酶标仪、天平(感量1/10000g)、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、 凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。 微量移液器(2μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL)、酶联板、研钵、离心管、花盆、灭菌 土等。 3.2 试剂 酶联免疫吸附测定试剂见附录B,RT-PCR检测试剂见附录C,实时荧光RT-PCR检测试剂见 附录D,生物学测定试剂参见附录E。 4 抽样与样品制备 4.1 抽样 抽样按照SN/T2122的规定进行。 4.2 马铃薯块茎样品的制备 将马铃薯块茎播于灭菌土中,于25℃生长并进行症状观察。待长出约10片叶后将表现症状的植 株编号,未表现症状的植株分组(10株为一组)并编号。采集叶片用于酶联免疫测定、RT-PCR检测、实 时荧光RT-PCR检测及生物学测定。 4.3 组培苗样品制备 将每瓶组培苗中的每个植株都进行采样,每瓶组培苗所采样品作为一个加样样品用于酶联免疫测 定、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测及生物学测定。 1GB/T31806—2015 5 检测方法 5.1 酶联免疫吸附测定 见附录B。 5.2 RT-PCR检测 见附录C。 5.3 实时荧光RT-PCR检测方法 见附录D。 5.4 生物学测定 参见附录E。 6 结果判定 样品经酶联免疫吸附测定为阴性或RT-PCR检测为阴性或实时荧光RT-PCR检测为阴性,判断待 检样品不携带马铃薯V病毒。 样品经酶联免疫吸附测定为阳性,RT-PCR检测或实时荧光RT-PCR检测为阳性,即可判断待检 样品携带马铃薯V病毒。必要时可进行生物学测定。 7 样品保存与结果记录 7.1 样品保存 经检测确定携带马铃薯V病毒的样品应在合适的条件下保存,块茎可在4℃保存6个月,组培苗 可在-20℃或-80℃冰箱中保存1年,做好标记和登记工作。 7.2 结果记录 完整的记录包括:样品的来源、时间、地点、方法和结果等,并应有经手人和实验人员的签字。酶联 测定应有酶联板反应的原始数据,RT-PCR检测应有电泳结果图片,实时荧光RT-PCR检测应有反应 原始数据,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。 2GB/T31806—2015 附 录 A (资料性附录) 马铃薯V病毒相关资料 A.1 背景资料 A.1.1 基本信息 学名:PotatovirusV,缩写:PVV。 分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae),马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。 A.1.2 方法原理 根据马铃薯V病毒与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行ELISA检测;根据该病毒核酸的序 列进行PCR特异性检测,通过电泳条带大小进行结果判定;根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧 光探针,通过检测的荧光信号进行结果判定。条件允许的情况下,根据马铃薯V病毒侵染寄主的症状 特点,进行生物学检测。 A.2 寄主范围 马铃薯V病毒自然侵染仅限马铃薯。 A.3 病害症状 侵染的植株叶片灰白,新生叶变小,轻度扭曲,可能发展为花叶和坏死斑。 A.4 分布地区 分布于秘鲁、法国、荷兰和英国。 A.5 传播方式 蚜虫传播,传播马铃薯V病毒的蚜虫种类为Myzuspersicae、Brachycaudushelichrysi、Macrosi- phumeuphorbiae、Rhopalosiphoninuslatysiphon。 A.6 粒体形态 线状粒体,直径11nm~13nm,主体长度为760nm。 3GB/T31806—2015 附 录 B (规范性附录) 酶联免疫吸附测定 B.1 试剂 B.1.1 抗体 DAS-ELISA方法:包被抗体为多克隆抗体,检测抗体为多克隆抗体(酶标抗体)。 B.1.2 底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。 B.1.3 包被缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g 叠氮钠(NaN3) 0.20g 蒸馏水定容至1L,4℃储存。 B.1.4 PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl) 8.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g 氯化钾(KCl) 0.2g 吐温-20(Tween-20) 0.5mL 叠氮钠(NaN3) 0.2g 蒸馏水定容至1L。 B.1.5 样品抽提缓冲液(pH7.4) PBST 1L 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g PVP(MW24000~40000)20.0g 叠氮钠(NaN3) 0.20g 4℃储存。 B.1.6 酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4) PBST 1L BSA(牛血清白蛋白) 2.0g PVP(MW24000~40000)20.0g 叠氮钠(NaN3) 0.2g 4℃储存。 4GB/T31806—2015 B.1.7 底物缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺 97mL 氯化镁(MgCl2) 0.1g 叠氮钠(NaN3) 0.2g 溶于800mL蒸馏水,用盐酸调pH值至9.8,然后用蒸馏水定容至1L。4℃储存。 B.2 试验步骤 B.2.1 包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100μL。酶联板加盖或用保鲜膜 包好,放在37℃孵育2h。清空孔中溶液,用PBST加满各孔,3min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍 干。再重复2次上述洗板过程。 B.2.2 样品制备与加样 待测样品按1∶10(质量∶体积)加入抽提缓冲液,在研钵中研磨,2000r/min离心10min,上清液 即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。加入制备好的检测样品、阴 性对照、阳性对照,100μL/孔,酶联板加盖或用保鲜膜包好,放在4℃孵育过夜。酶联板用自来水彻底 冲洗,再用PBST洗涤3次,每次3min。 B.2.3 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加入到酶联板中,100μL/孔,酶联板 加盖或用保鲜膜包好,37℃,4h。酶联板用自来水彻底冲洗,再用PBST洗涤3次,每次3min。 B.2.4 加底物 将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),100μL/孔加入到酶联板中, 室温避光孵育。 B.2.5 读数 在不同的时间内如30min、60min、90min、120min或更长时间,用酶联仪在405nm处读OD值。 B.3 结果判定 对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应该在质量控制范围内,即:缓冲液孔和阴 性对照孔的OD405值<0.15,当阴性对照孔的OD405值<0.05时,按0.05计算;阳性对照OD405值/阴性 对照OD405值>5;同一样品的重复性基本一致。 在满足了上述的质量要求后,结果原则上可判断如下:样品OD405值/阴性对照OD405值明显>2,判 为阳性;样品OD405值/阴性对照OD405值在2左右,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验 证;样品OD405值/阴性对照OD405值明显<2,判为阴性。 若满足不了上述的质量要求,则不能进行结果判断。 5GB/T31806—2015 附 录 C (规范性附录) RT-PCR检测 C.1 试剂 C.1.1 核酸提取试剂 核酸提取试剂为TRIzol试剂。 C.1.2 50×TAE 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242g 冰乙酸 52.1mL 乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2H2O)37.2g 加蒸馏水至1L。用时加蒸馏水稀释至1×TAE。 C.1.3 6×加样缓冲液 0.25%溴酚蓝; 40%(质量分数)蔗糖水溶液。 C.2 试验步骤 C.2.1 总RNA提取 取0.1g样品,加入1mLTRIzol试剂充分研磨,室温放置5min;12000g离心5min,取上清液到 另一离心管中;加入三氯甲烷500μL,充分振荡15s,室温放置3min;12000g,4℃离心15min;取上 层水相加入另一离心管中,加入等体积异丙醇;12000g,4℃离心10min,弃去上清液;加入1mL 70%乙醇洗涤;RNA沉淀干燥后,加经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH2O40μL溶解即可。 C.2.2 引物序列 根据马铃薯V病毒的CP基因序列(GeneBank序列号:X61279.1)设计引物对如下: PVV-CP-F: