ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31809—2015 油棕猝倒病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPythiumsplendensBraun 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:张慧丽、张建成、顾建锋、郑炜、徐瑛、陈先锋、段维军、陈吴健、吴志毅、杜洪忠、 吴品珊。 ⅠGB/T31809—2015 油棕猝倒病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了油棕猝倒病菌的形态学和分子生物学检疫鉴定方法。 本标准适用于油棕猝倒病菌寄主植物的植株、插枝等植物材料及介质的检疫鉴定。 2 仪器设备 生物显微镜(具油镜镜头)、具透射光源的体视显微镜(最大放大倍数不低于50×)、高压灭菌锅、天 平(感量1/100g,1/10000g)、研钵、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、台式离心机、分光光度计、高速冷冻 离心机、真空抽干仪、低温冰箱、冷藏冷冻冰箱、超净工作台、普通PCR仪、光学PCR反应管、pH计、电 泳仪、水平电泳槽、实时荧光PCR仪、微量移液器(0.5μL、2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、 1000μL)、PCR反应管(0.2mL、0.5mL)、锥形瓶、试管、培养皿、载玻片、盖玻片。 3 主要试剂和培养基 除另有规定外,所有试剂均采用分析纯。无菌双蒸水、液氮、蛋白酶K、氢氧化钠、醋酸铵、氯化钾、 无水乙醇、溴化乙锭、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、氨苄青霉素、利福平、制霉菌素、苯菌灵、氯化钠、 CTAB、TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、10×PCR缓冲液、琼脂糖、DNA分子量标准、Tris/EDTA/ SDS提取缓冲液(TES)、Tris/EDTA缓冲液(TE)、Tris硼酸盐EDTA缓冲液(TBE)等。培养基及缓 冲液配制方法见附录B。 4 检疫鉴定 4.1 症状检查 仔细检查根部,根部症状是软化变褐,腐烂;茎部症状是出现灰色或棕黑色水渍状斑点(参见 附录A)。对可疑植物和繁殖材料的介质土应取样做进一步检验。 4.2 组织分离 选萎蔫及根部变褐但没有完全腐烂的植物材料,用流动的自来水冲洗干净,在根茎病健交界处切取 0.5cm×0.5cm的小块组织,用1%次氯酸钠进行表面消毒3min,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干表面 水分后,置于选择性培养基上,25℃~30℃黑暗培养,每天观察,待长出菌丝后,挑取菌丝尖端转移到 基础培养基上纯化,保存备用。 4.3 土壤诱集 对禾本科植物叶片(如:马唐、狗尾草、稗草等)进行高温高压灭菌处理,剪成直径1cm大小的小片 作为诱饵。取5g~20g土壤样品研磨破碎放入50mL灭菌洁净烧杯中,厚度不超过2cm,缓慢加入无 菌水没过土表1cm~2cm,用吸水纸轻轻去掉形成的表面膜和漂浮的有机物残渣,每烧杯水面放置诱 饵10片左右。静置过夜,体式显微镜下观察,将有菌丝体长出的诱饵取出,用无菌水洗净表面,无菌吸 1GB/T31809—2015 水纸吸干,放入选择性培养基平板上培养。待长出菌落后镜检,菌丝体呈棉絮状,分枝,无隔多核,挑取 菌丝尖端转移到基础培养基上纯化,保存备用。 4.4 培养物观察 得到病菌纯培养物后,挑出菌丝制片。用解剖针将菌丝尽量展开,观察病菌特征。需测量不少于 30个菌丝膨大体大小,计算平均值。 4.5 PCR鉴定方法 PCR鉴定方法见附录C。 5 鉴定特征 5.1 培养性状 在基础培养基上菌落边缘整齐,气生菌丝发达,蛛丝状。 5.2 形态特征 5.2.1 菌丝和菌丝体 菌丝不规则分枝,菌丝宽3.5μm~9.2μm,平均6.4μm。培养基上菌丝膨大体丰富,叶片诱集可产 生大量菌丝膨大体。菌丝膨大体(参见附录A)球形至近球形,光滑,通常顶生,很少间生,直径25μm~ 49μm,在异宗配合腐霉中油棕猝倒病菌的菌丝膨大体直径最大,平均38μm,其余种菌丝膨大体平均 直径小于30μm,菌丝膨大体内充满颗粒状原生质,菌丝膨大体需在有水的情况下经数小时萌发,萌发 时每个膨大体产生1个~6个芽管,不产生游动孢子囊和游动孢子。 5.2.2 有性生殖阶段特征 有性繁殖为异宗配合,但有些分离物单培养也可以形成藏卵器,藏卵器也可以出现在老化的培养物 或培养数年的菌株上。藏卵器顶生或间生,球形,器壁光滑、薄,直径24μm~38μm。雄器异丝生,顶 生,偶尔间生,每个藏卵器1个~8个雄器,柄有时分支或分叉,多个雄器同时围绕一个藏卵器,雄器细 胞大,通常20μm×15μm,直或颈状弯曲。卵孢子游离在藏卵器内,不满器,与藏卵器的比例为1∶1.2, 直径20μm~33μm,壁光滑,薄,壁厚1μm~2μm(参见附录A)。 6 结果判定 以油棕猝倒病菌在寄主上的症状、分离物的培养特征、无性及有性世代阶段特征等作为鉴定依据, 进行综合判定。若以上特征与第5章鉴定特征吻合,则鉴定为油棕猝倒病菌。若菌丝膨大体平均值小 于38μm,应进行分子鉴定,分子鉴定结果为阳性,可判定为油棕猝倒病菌。 7 样品保存与结果记录 7.1 样品保存 经检验确定携带油棕猝倒病菌的样品,经登记和标记后视样品的状态采用相应的保存方式,妥善保 存6个月,以备复核。保存期满后,应经灭菌处理。 2GB/T31809—2015 7.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为油棕猝倒病菌的菌株,应妥善保存。对不需要长期保存的菌株应及时 高压灭菌处理。 7.3 结果记录与资料保存 需要保存的记录包括:样品的种类、自然状态、来源、被为害状及为害程度(无症状也要说明),诊断 时使用的方法,PCR检测应有电泳结果照片,鉴定实验室的名称,负责人和鉴定人的签字等。 3GB/T31809—2015 附 录 A (资料性附录) 油棕猝倒病菌相关信息 A.1 油棕猝倒病菌基本信息 学名:PythiumsplendensBraun 异名:Globisporangiumsplendens 中文名:油棕猝倒病菌、油棕苗疫病菌、天竺葵黑胫病菌、华丽腐霉 分类地位:藻菌界(Chromista),卵菌门(Oomycota),卵菌纲(Oomycetes),腐霉目(Pythiales),腐霉 科(Pythiaceae),腐霉属(Pythium)。 近似种:腐霉属中异宗配合且产生球状菌丝膨大体的种有4种,其中间型腐霉(P.intermedium)菌 丝膨大体为链生,与其他3种差异明显,本标准列出了油棕猝倒病菌与其他3种近似种的主要区别。 传播途径:通过带菌的土壤和繁殖材料进行传播。 A.2 方法原理 根据油棕猝倒病菌在寄主植物上的症状,通过组织分离、土壤诱集对病原菌进行分离培养,采用形 态学(参见A.4)和分子生物学方法对病原菌进行鉴定(见附录B和附录C)。 A.3 病害症状 在大多数寄主植物上引起种腐,出苗前疫病或苗期猝倒,在红薯上产生坏死斑,在天竺葵属(Pelar- goniumspp.)植物上引起黑胫病,在胡椒(Pipernigrum)上引起萎蔫症状,在大黄(Rheumofficinale) 上引起冠腐,在芦荟属(Aloespp.)植物上引起根腐。图A.1所示为油棕猝倒病菌在卡瓦胡椒(Piper methysticum)上的为害症状。 4GB/T31809—2015 说明: a———根腐; b———根和茎基部腐烂; c———萎蔫; d———根腐,植株衰退。 注:引自ScotNelson,2005。 图A.1 油棕猝倒病菌在卡瓦胡椒(Pipermethysticum)上的为害症状 5GB/T31809—2015 A.4 形态特征(见图A.2和图A.3) 说明: a~c———菌丝膨大体,a、b为顶生,c为间生; d———菌丝膨大体萌发产生芽管; e———藏卵器、雄器; f~l———藏卵器、雄器、卵孢子。 注:引自HonH.Ho2011,标尺均为20μm。 图A.2 油棕猝倒病菌的形态特征 6GB/T31809—2015