ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 35271—2017 玉米褪绿矮缩病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Maize chlorotic dwarf virus 2018-07-01实施 2017-12-29发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 35271—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 国福建出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴兴海、郑媛、邓明俊、纪瑛、栗志平、张云霞、封立平、沈建国。 GB/T35271—2017 玉米褪绿矮缩病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了玉米褪绿矮缩病毒的检疫和鉴定方法。 本标准适用于进出境粮谷作物上玉米褪绿矮缩病毒的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T 2964 植物病毒检测规范 3. 玉米褪绿矮缩病毒基本信息 学名:Maize chlorotic dwarf virus。 异名:Ohio corn stunt agent。 缩写：MCDV。 分类地位：伴生豇豆花叶病毒科（Secoviridae）、水稻矮化病毒属（Waikavirus）。 玉米褪绿矮缩病毒的其他信息参见附录A 4 方法原理 根据该病毒的生物学、免疫学和分子生物学特性，利用基于抗原抗体反应的双抗体夹心酶联免疫吸 附测定（DAS-ELISA）、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光RT-PCR及免疫电镜（IEM)进行 检测鉴定 仪器设备和主要试剂 C 5.1仪器设备 电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超 低温冰箱（一80℃）、旋涡振荡器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、荧光PCR仪、微波炉、电泳 仪、电泳槽、凝胶分析成像系统、酶联检测仪、透射电子显微镜。 5.2用具 可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL)及吸头、离心管、PCR管和研钵等。 1 GB/T35271—2017 5.3 主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。双抗体夹心酶联 免疫吸附测定试剂见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C；免疫电镜检测试剂见SN/T1840。 6检测与鉴定 6.1取样 对于有症状的样品选取表现症状的样品组织，对于无症状的样品抽样方法按照SN/T2122进行 6.2 2双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把0.5g～1.0g样品充分研磨或在液氮中研磨，按1：10比例加人样品提取缓冲液，转移到离心管 中，8000r/min离心5min，上清液作为DAS-ELISA的检测提取缓冲液。 设置阴性对照、阳性对照和空白对照，具体操作过程见附录B。 注：提取液在3h内使用，否则保存于4℃中。 6.3 3RT-PCR检测 分别提取样品总RNA后，进行RT-PCR检测。 设置阴性对照（健康植物组织）、阳性对照（感染MCDV的植物组织）和空白对照（ddH,O），具体操 作过程见附录C。 6.4实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同6.3，双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对 照的RNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D 6.5 5免疫电镜检测 按照SN/T1840中规定的方法制备样品和进行电镜观察病毒粒子形态。在免疫电镜下如观察到 天小为28nm～~30nm的二十面球体，即可判定结果阳性。 6.6测序 当PCR产物回收后进行测序 7结果判定 当产生以下检测结果时，则判定为检出MCDV，否则判定为未检出MCDV： 当酶联免疫检测、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测、免疫电镜检测中有两种及两种以上 的检测结果呈阳性时，判定为检出玉米褪绿矮缩病毒； 当RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的MCDV序列一致，判定为检出玉米褪绿矮 缩病毒。 2