ICS 65.020.30 B 43 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 31581—2015 牛性控冷冻精液生产技术规程 Code of pratice on production of bovine frozen sexed-semen 2015-05-15发布 2015-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31581—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（北京）、内蒙古赛科星繁育生物技术股 份有限公司、北京奶牛中心、中国农业大学、全国畜牧总站、农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心 （南京）。 本标准主要起草人：张晓霞、李喜和、周文忠、刘海良、孙飞舟、张胜利、陆汉希、杨清峰、武玉波、 钱松晋、张海涛、刘玉、赵鹏、王建国、胡树香、张勇、胡志刚。 I GB/T 31581—2015 牛性控冷冻精液生产技术规程 1范围 冻、解冻、检验、包装、贮存及运输。 本标准适用于采用流式细胞分离技术生产牛性控冷冻精液。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4143牛冷冻精液 GB/T5458液氮生物容器 GB/T31582牛性控冷冻精液 NY/T1234牛冷冻精液生产技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 精子分离 sperm sorting 根据X精子和Y精子DNA含量的差异，利用流式细胞分离方法将X精子和Y精子分离开 3.2 性控冷冻精液 frozen sexed-semen 分离后富含X精子或Y精子、经超低温冷冻后在液氮中长期保存的精液。 采精用品清洗和消毒 4 按照NY/T1234的规定执行。 5 溶液配制与灭菌 5.1 溶液配制 5.1.1 稀释液 稀释液配制见附录A中A.1。 5.1.2 分离机缓冲液Tris-sheath 分离机缓冲液Tris-sheath的配制见A.2。 1 GB/T 31581—2015 5.1.3 荧光染色液和食品红染色液 荧光染色液和食品红染色液配制见A.3。 5.1.4精子染色液 精子染色液的配制见A.4。 5.1.5 精子收集液 精子收集液配制见A.5。 5.2 溶液灭菌 溶液在使用前进行高压蒸汽灭菌（120kPa，15min），对于不能高压灭菌的溶液使用0.22μm过滤 器进行过滤除菌。 主要仪器设备 6 流式细胞仪、精液分装机、细管印学机、程序冷冻仪、荧光显微镜、离心机、精子密度仪 7采精 按照NY/T1234的规定执行。 8 精液处理 精液处理方法按照NY/T1234的规定执行，精液分离前应添加抗生素并在18℃～20℃的环境下 保存，储存时间不超过16h。 9 精子分离 9.1 分离环境 精子分离实验室应保持洁净，室温控制在18℃～25℃，无振动源。 9.2 分离前处理 根据所采原精密度，按比例进行染色。 示例：对4亿个精子进行染色，用染色原液稀释到2亿个/mL，加人15μL～30uLHochest33342荧光染色液放人 5mL分离专用试管，混勾后放入34℃水浴，加盖避光温育45min。再加入2mL含4%卵黄的食品红染色液，最后制成 精子分离样品。 9.3 3分离 按照分离机操作规程分离。 2 GB/T31581—2015 10 分离精液冷冻 10.1稀释平衡 分离后的精液在4℃士1℃条件下平衡90min后同温1750g离心5min，去除上清液。然后用 20%卵黄Tris-A液稀释收集后的分离精液，使精子密度≥2000万个/mL。之后添加等量的含12%甘 油的Tris-B液，平衡20 min。用1：1的Tris-A液、Tris-B液将最终精子密度调整为 ≥1000万个/mL。 10.2分装 平衡后的精液在4℃土1℃条件下灌装、封口、印字，在细管上打印生产单位代号、品种、牛号、生产 日期或批号（见附录B）、性控标记等信息。 10.3冷冻、包装 的初冻温度调节至一90℃，控制降温过程，在20min到达一120℃后投人液氮中。冷冻结束后进行包 装，包装应在一140℃以下进行。保存性控冷冻精液的液氮生物容器应符合GB/T5458的规定。 11入库前检查 检验，方法见GB/T31582。检验合格后方可人库。 贮存、运输 12 按照NY/T1234的规定执行。 3