ICS 65.120 B 46 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 23385—2009 饲料中氨芒青霉素的测定 高效液相色谱法 Determination of ampicillin in feed- High performance liquid chromatography 2009-03-26发布 2009-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23385—2009 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)提出并归口。 本标准起草单位：黑龙江省兽药饲料监察所 本标准主要起草人：金慧然、叶建敏、范锡龙、郭文欣、陶娅、江淼、李春辉 GB/T23385—2009 饲料中氨苄青霉素的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了用高效液相色谱（HPLC）法测定饲料中氨青霉素的含量。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中氨芋青霉素含量的测定。 本标准检出限为1.0mg/kg，定量限为5.0mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD） GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT) GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195—2006,ISO6498：1998,IDT） 3原理 用磷酸盐缓冲液提取试样中的氨苄青霉素，高效液相色谱仪反相色谱系统分离，紫外检测器或二极 管矩阵检测器在波长220nm处进行定性、定量测定。 4试剂和溶液 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。 4.1乙：色谱纯。 4.2磷酸二氢钾溶液，c(KH,PO,）=0.02mol/L：准确称取2.72g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶中， 加水溶解稀释至刻度。 4.3提取液：磷酸二氢钾溶液（4.2）十乙腈（4.1）=19十1。 4.4HPLC流动相：取920mL磷酸二氢钾溶液（4.2)和80mL乙睛（4.1），混合均匀，通过0.45μm的 溶剂微孔过滤膜过滤，使用前用超声波脱气。 4.5氨苄青霉素标准贮备液：准确称取氨苄青霉素标准品（含量不少于86.5%）50mg（精确至0.00001g）， 于50mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，摇匀。其溶液浓度为1.0mg/mL，贮于4℃～6℃冰 箱中，有效期2d。 4.6氨苄青霉素标准工作液：准确移取氨苄青霉素标准贮备液（4.5）适量，用水稀释成浓度分别为 1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL,50.0μg/mL、100.0μg/mL,现用现配。 5仪器和设备 5.1分析天平：感量为0.00001g和0.0001g各1台。 5.2高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管矩阵检测器。 5.3超声波清洗机。 5.4振荡器。 1 SAC GB/T23385—2009 5.5 离心机。 5.6涡旋混合器。 5.7 微孔滤膜：0.45μm。 6试样制备 6.1按GB/T14699.1采样 6.2选取有代表性样品至少500g，按GB/T20195进行样品制备，粉碎，全部通过孔径为0.45mm的 孔筛，充分混匀，装入密闭容器中，避光保存，备用。 7分析步骤 7.1试样溶液的制备 称取饲料样品5g，精确至0.0001g，置于100mL三角瓶中，准确加入25mL提取液（4.3），于振 荡器上振荡提取5min，把溶液转人离心管中以5000r/min离心10min，取上清液过0.45μm的微孔 滤膜，供高效液相色谱仪测定。 7.2色谱条件 色谱柱：Cls柱（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm）或类似分析柱。 柱温：室温。 检测器：紫外检测器或二极管矩阵检测器，检测波长220nm。 流动相：磷酸二氢钾溶液（4.2）十乙腈（4.1）=92十8。 流速：1.0mL/min。 进样量：20μL。 7.3HPLC测定 按高效液相色谱仪说明书调整仪器参数。向高效液相色谱仪中注入氨苄青霉素标准工作液（4.6） 及试液（7.1），得到色谱峰面积响应值，用标准系列进行单点或多点校准。 结果的计算与表述 8 试料中氨青霉素的含量X以质量分数表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1)计算： A :(1) A. 式中： 试样提取液测得的色谱峰面积； A，一氨苄青霉素标准工作液测得的色谱峰面积； 标准工作液中氨苄青霉素含量，单位为微克每毫升（μg/mL）； V—加到试样中的提取液体积，单位为毫升(mL)； m 试样质量，单位为克（g）。 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。 重复性 9 同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于10%。 2 GB/T23385—2009 附录A （资料性附录） 氨苄青霉素标准样品色谱图 图A.1给出了氨苄青霉素高效液相色谱图。 mAL 10. 610 120 11 100 80 60 40 20 0 3 4 10 8 11 12 图A.1 氨苄青霉素高效液相色谱条件下标准样品色谱图